Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рекомбинантные Fv-фрагменты антител, которые были названы одноцепочечными Fv (single-chain Fv - scFv), представляют собой объединенные в одну полипептидную цепь VH- и Уь-участ-ки полипептидных цепей иммуноглобулинов, соединенные коротким пептидным линкером (рис. 55,6). Недостатками таких молекул являются одновалентность, сопровождаемая низкой аффинностью, и низкая молекулярная масса (~30 кДа), что приводит к их быстрой протеолитической деградации в кровотоке. Для решения этих проблем рекомбинантные scFv-модули объединяли с помощью пептидных линкеров или адгезивных белковых доменов в мультимерные агрегаты. Простейшим вариантом рекомбинантных мультимеров являются димеры с молекулярной массой ~60 кДа, получившие название димерных миниантител (dia-body) [222]. В такой конструкции домены VH и VL в каждом модуле scFv соединены коротким пятизвенным пептидным линкером, что препятствует внутримолекулярному объединению V-доме-нов и способствует агрегации scFv-модулей друг с другом (рис. 55,6). Димерные миниантитела обладают двумя функциональными антигенсвязывающими сайтами. Неожиданно оказалось, что уменьшение длины линкера до трех остатков и менее, подавляет образование димерных миниантител и вместо этого три молекулы scFv объединяются в тример (тримерные миниантитела - triabody) с тремя антигенсвязывающими сайтами и молекулярной массой ~90 к Да [222] (рис. 55,6). Также были получены четырехвалентные тетрамеры в результате объединения четырех молекул scFv, названные тетрамерными миниантителами (tetrabody) [223].
Рекомбинантные антитела с несколькими специфичностями. Во всех случаях, рассмотренных выше, возможно объединение в единый комплекс scFv-модулей с разными антигенсвязывающими сайтами, что приводит к образованию антигенсвязываю-щих белков с несколькими специфичностями. Простейшая макромолекула, которая обладает двумя специфичностями, должна взаимодействовать с двумя разными эпитопами, расположенны-
ми на одной молекуле антигена (рис. 55,в). Это повышает ее авидность по отношению к антигену-мишени. Кроме того, молекула антитела с двумя специфичностями может быть сконструирована таким образом, что будет в состоянии одновременно распознавать разные антигены. Подобные белковые конструкции привлекательны для применения в терапии онкологических и других заболеваний, при которых требуется элиминация соматических клеток.
Стратегия использования антител с двумя специфичностями для этих целей такова: один антигенсвязывающий участок взаимодействует с антигеном-маркером клетки-мишени, а другой специфически распознает эпитопы на поверхности цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов, макрофагов или цитолитического вируса, облегчая их контакт с клеткой, которую необходимо элиминировать [224,225]. Аналогичный подход может быть применен и для радиотерапии: здесь антитела с двумя специфичностями используют для адресной доставки к опухолевым клеткам радиолиганда, поражающего клетки-мишени [226]. Кроме того, антитела с несколькими специфичностями могут быть получены с помощью уже упомянутых выше химических методов путем образования поперечных сшивок между остатками cys в шарнирных областях Fab-фрагментов [227]. Альтернативно антитела с двумя специфичностями могут быть синтезированы с помощью гибридных гибридом, иначе называемых квадромами (quadroma). Квадромы являются продуктом слияния клеток двух разных клеточных линий гибридом и во время культивирования секретируют в виде единого гибридного белка антитела с двумя специфичностями, в котором тяжелые и легкие цепи, различающиеся антигенсвязы-вающими участками, объединяются случайным образом [228]. К сожалению, случайное объединение тяжелых и легких цепей в таких гибридных клетках приводит к образованию до десяти различных вариантов антител, из которых только один обладает истинной двойной специфичностью. К тому же сам процесс производства антител двумя вышеупомянутыми методами является весьма трудоемким и дорогостоящим. Эти и ряд других недостатков обсуждавшихся методов получения антител с двумя специфичностями стимулировали исследования, направленные на их получение генно-инженерными методами.
Все рассмотренные выше подходы, используемые для получения рекомбинантных поливалентных антител, могут быть применены и для конструирования макромолекул с несколькими специфичностями. В этом случае, димеризуя scFv-модули разными методами, получают антитела двойной специфичности трех
типов: миниантитела (minibody), одноцепочечные антитела двойной специфичности (sc-bsAb) и димерные антитела. Для ге-теродимеризации scFv-модулей при получении миниантител используют домены типа “лейциновая застежка” факторов транскрипции Fos и Jun, которые встраивают генно-инженерными методами в полипептидные цепи разной специфичности [229]. Такой подход обеспечивает при сборке миниантител образование исключительно гетеродимеров. Объединение двух scFv-модулей разной специфичности в одной полипептидной цепи приводит к образованию sc-bsAb-антител. Такие рекомбинантные белки обладают достаточно высокой стабильностью in vivo и могут быть использованы в терапевтических целях [230]. Наконец, при конструировании димерных антител используют два рекомбинантных модуля разной специфичности, в которых VL- и Ун-последо-вательности соединены очень короткими пептидными линкерами, что исключает их внутримолекулярную димеризацию и обеспечивает образование гетеродимеров, составленных из разных молекул.
