Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Разработанный метод позволил авторам осуществить ИЭФ пептидов в пластинах 7%-ного ПААГ (С=4), полимеризован-ного в 2%-ном водном растворе амфолинов для диапазона pH
3,5—10 в присутствии 8 М мочевины. Нечувствительный к присутствию амфолинов метод окрашивания играет здесь решающую роль, так как нет возможности осадить пептиды и вымыть из геля амфолины — первые приходится окрашивать в присутствии вторых. Мочевину вводят в гель во избежание агрегации пептидов. Впрочем, ее можно заменить добавками диметилсуль-фоксида или диметилформамида [Righetti, Chillemi, 1978].
Определенный интерес представляет недавно предложенный способ окрашивания белков после ИЭФ красителем «быстрый зеленый» («Fast Green»). Чувствительность этого способа в 2—3 раза меньше, чем при окрашивании СВВ R-250, однако Fast Green тоже не окрашивает амфолиты. При фракционировании пептидов уменьшение чувствительности может оказаться существенным недостатком, но при работе с белками отпадают необходимость вымывания амфолитов из геля и связанная с неполнотой такого вымывания неопределенность фона при окрашивании. Используют 0,25%-ный раствор красителя в 10%-ном растворе уксусной кислоты. Перед употреблением его следует дважды профильтровать. Максимальная окраска белков в геле развивается за несколько минут, однако отмывка не связавшегося с белком красителя смесью, содержащей 10% уксусной кислоты и 30% метанола, занимает примерно сутки. Достоинством данного метода является и тот факт, что линейная зависимость интенсивности окрашивания сохраняется до втрое больших концентраций белка в полосе, чем при использовании СВВ R-250 [Allen et al., 1980].
Еще один своеобразный вариант обнаружения полос пептидов в присутствии амфолитов — «негативая» окраска. Тонкие гели быстро сушат, а затем в течение 3—5 мин подвергают действию паров иода. Иод обратимо сорбируется на амфолитах, образуя интенсивно окрашенный коричневый фон. Полосы пеп-
тидов остаются бесцветными — их можно вырезать. Иод легко сублимируется и улетает [Gianazza et al., 1980а].
Окрашивание в две стадии. Б некоторых случаях, когда необходимо выявить белковые полосы, очень сильно различающиеся по своей интенсивности, операцию окрашивания имеет смысл провести в две стадии. На первой стадии гель окрашивают сравнительно малочувствительным способом, который по« зволяет различить границы близко расположенных интенсивных белковых полос. При использовании высокочувствительных методов окрашивания такие полосы нередко кажутся слившимися в одну за счет прокрашивания белка, диффундирующего в промежуток между ними. Промыв гель, приступают ко второй стадии— окрашивают его одним из чувствительных способов для выявления слабых полос белка, оставшихся неокрашенными на первой стадии.
В качестве слабого красителя для первой стадии можно использовать «Light Green SF». Пластину геля вымачивают в 5%-ном растворе ТХУ для фиксации белков и вымывания основной массы амфолитов, переводят ее в смесь метанол — вода— уксусная кислота (33:66:10), а затем окрашивают 0,2%-ным раствором красителя в той же смеси. Продолжительность окрашивания в пределах 0,5—2 ч подбирают в зависимости от толщины геля и интенсивности полос белка, которые желательно выявить на этой стадии. Гель отмывают той же смесью растворителей и далее окрашивают одним из описанных высокочувствительных способов.
Ферментативные реакции. Повышенной чувствительности и избирательности окрашивания белков после ИЭФ можно достичь в тех случаях, когда удается использовать специфические ферментативные реакции, дающие окрашенные продукты. Несмотря на отсутствие в растворах соли, многие ферменты сохраняют при ИЭФ не только растворимость, но и специфическую активность. Этому способствуют находящиеся в растворе амфолиты. Однако в некоторых случаях целесообразно преодолеть буферный эффект амфолитов и изменить pH раствора до значения, оптимального для данной реакции. Этого можно добиться либо внесением кусочка геля в сильно забуференный раствор других ингредиентов ферментативной реакции, либо предварительным кратковременным вымачиванием геля в нужном буфере с концентрацией 0,1—0,2 М (средняя молярность каждого из амфолитов при 2%-ном их суммарном содержании в растворе составляет 0,02—0,05 М).
Иногда утрата ферментативной активности сфокусированных белков может быть связана с хелированием амфолитами каких-либо металлических кофакторов. Эту активность нередко удается восстановить инкубацией геля в растворе соли соответствующего металла. Как и после электрофореза, можно снимать зимограммы путем наложения на гель после ИЭФ пластинки агарозы или слоя фильтровальной бумаги, пропитанной раств>
ром необходимых субстратов и дополнительных ферментов для осуществления цепи реакций, приводящей к образованию окрашенного продукта [Wadstrom, Smith, 1975]. Подробнее эти подходы были рассмотрены ранее [Остерман, 1981].
В качестве иллюстрации приведем пример анализа изозимов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из лизатов эритроцитов человека [Vergnes, 1979]. Содержание и изозимный состав этого фермента в крови представляет интерес для медицины. Отклонения от нормы здесь могут приводить к острым явлениям гемолиза в ответ на употребление в пищу определенных продуктов или использование некоторых медикаментов, например сульфамидов. Изозимы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы пациентов с различными заболеваниями крови, в том числе с острой гемолитической анемией, фракционировали методом ИЭФ в горизонтальной пластинке ПААГ (pH 5—8,5) на приборе Мультифор. Окрашивание фермента проводили за счет реакции восстановления НАДФ с переброской электрона в конце цепи с помощью фе-назинметасульфата на тетразолиевую соль (МТТ), дающую сильноокрашенный продукт [Остерман, 1981].
