Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
По окончании электрофореза полосы и пятна препарата в геле фиксируют, например 10%-ным раствором ТХУ. Можно их
окрасить и сфотографировать. При последующей обработке ДМСО краска расплывется, поэтому положение полос пре* парата лучше сразу после окрашивания зафиксировать проколами в геле.
Затем пластину ПААГ вымачивают в течение часа в двух сменах ДМСО (по 20 объемов по отношению к объему геля). Надо не забывать, что ДМСО ядовит и проходит через кожу; работать следует в перчатках! После этого гель переносят на 3 ч в четыре объема 22%-ного (вес/объем) раствора ППО в ДМСО. За это время ППО входит в гель. Но ДМСО не является сцинтилляци* онным растворителем, поэтому его надо убрать, но так, чтобы ППО (пусть в твердом виде) остался в геле. Высушить ДМСО трудно. Вместо этого гель вымачивают в течение часа в 20 объемах воды. ДМСО внутри геля снова заменяется на воду, а ППО не вымывается, так как выпадает в осадок. Гель быстро стано-вится белым и непрозрачным, а его линейные размеры, несколько сократившиеся в ДМСО, восстанавливаются. Затем гель высушивают в вакууме, как описано выше. На бумажном фильтре получают прочно приставшую, жесткую и непрозрачную белую пленку, состоящую в основном из твердого сцинтиллятора, в который вкраплены полосы радиоактивного препарата. Несмотря на кажущуюся непрозрачность этой пленки, свет от вспышек сцинтилляций в ее глубине доходит до наложенной сверху рентгеновской пленки и оставляет на ней почернения в местах, расположенных непосредственно над радиоактивным материалом. Используют экранированную рентгеновскую пленку одной из указанных выше марок, экспозицию ведут при —70°.
Чувствительность метода позволяет при исходной толщине ПААГ в 1,5 мм зарегистрировать за 24 ч экспозиции радиоактивность трития в 30000 расп./мин на 1 см2.
Гели, содержащие менее 2% акриламида (обычно смешанные с агарозой), могут раствориться в ДМСО. Для них лучше пользоваться 10%-ным раствором ППО в метаноле. Обработка аналогична: двукратное вымачивание геля в 20 объемах метанола и т. д. Для более концентрированных гелей метанол не пригоден— они в нем слишком сильно сжимаются [Bonner, Laskey, 1974; Laskey, Mills, 1975]. Метод Боннера и Ласки не свободен от недостатков: он трудоемок, связан с использованием токсичного растворителя и дорог из-за большого расхода ППО. В связи с этим были предприняты поиски путей его усовершенствования.
Было найдено, что ППО можно вводить внутрь геля растворенным не в ДМСО, а в ледяной уксусной кислоте, что удобнее и менее опасно — кислота не так токсична и не проникает через кожу. Для флюорографии гелей агарозы ДМСО вообще непригоден, так как агароза в нем растворяется. Метанол агарозу не растворяет, но вызывает образование пузырей в геле и трещины при высушивании. Уксусная кислота свободна от этого недостатка. Кроме того, ППО в ней лучше растворим, что позволяет уве-
личить его содержание в высушенном геле и повысить тем самым чувствительность метода. Впрочем, это существенно только для ПААГ. Оказалось, что максимальная чувствительность достигается при соотношении ППО и матрицы геля, равном 2,5:1. Для гелей агарозы характерно примерно в 10 раз меньшее содержание сухого материала, чем для ПААГ, поэтому гели агарозы с концентрацией более 1,2% и толщиной более 2 мм следует просто вымачивать (временами покачивая) в растворе ППО в ледяной уксусной кислоте, концентрация которого в 2,5 раза больше, чем концентрация геля. ППО растворяется и в слегка разбавленной СНзСООН, поэтому нет нужды предварительно переводить гель в чистую уксусную кислоту. В начале вымачивания, когда вода из геля еще не уравновесилась со всем объемом кислоты, ППО частично выпадает в осадок, но потом он исчезает. Вымачивание после этого следует продолжать еще в течение часа. В общей сложности оно занимает около 3 ч. Затем гель переносят в воду еще на час, а затем сушат в вакууме при 45°, помогая высушиванию сжатием, как обычно для гелей агарозы. Флюорографию тонкой и плотной пленки высушенного геля ведут по методу Боннера и Ласки [Burckhardt et al., 1979].
Тонкие гели агарозы низкой концентрации отличаются хрупкостью. Авторы, подробно исследовавшие этот метод [Pulley-blank, Booth, 1981], предлагают для них несколько иную обработку. Сначала такой гель агарозы (<1,2% или тоньше 2 мм) высушивают в указанных выше условиях на листке «Whatmann ЗММ>, затем высушенный гель вместе с этой подложкой помещают на 10 мин в воду. Гель слегка набухает и легко снимается с бумаги. Концентрация его теперь намного выше, чем в исходном состоянии. Тонкую, но прочную и гибкую пластинку гидратированной агарозы переносят на 5 мин в 15%-ный раствор ППО в ледяной уксусной кислоте, а затем еще на 5 мин — в 30%-ный. После этого для осаждения ППО достаточно подержать гель в воде 10 мин. Затем его можно сушить на любой подложке в воздухе при комнатной температуре или на фильтровальной бумаге, как обычно, в вакууме. Остальное проделывают, как описано выше.
Пластины ПААГ, также без предварительного перевода в чистую кислоту, можно вымачивать в 20%-ном растворе ППО в уксусной кислоте до растворения временного осадка и еще в течение часа. Затем их вымачивают один час в воде и сушат в вакууме при 80°.
