Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
Появление методов быстрого и точного измерения концентраций метаболитов сделало возможным использование рас-
смотренного метода определения К' для широкого круга биохимических реакций. Однако для реакций, которые сопровождаются большими изменениями стандартной свободной энер-' гии AG° (т. е. когда реакция протекает почти до конца в одном направлении), значение К' чрезвычайно велико. При равновесии. концентрации субстратов будут очень малы, что значительно затрудняет их определение. В таких случаях значения К' могут быть рассчитаны из кинетических или термодинамических данных.
Необходимыми для расчета К' ферментативной реакции (односубстратный фермент) кинетическими данными являются максимальная каталитическая активность в обоих направлениях (Ушах) и значения Кы Для субстрата и продукта. Значения К' из этих данных могут быть рассчитаны с помощью уравнения Холдейна [21]. Для реакции Ач^В
Г Я 1 кв
[А] __ "max
Можно также рассчитать значение К' из изменения свободной энергии реакции с помощью уравнения
ДС-Д<Г+*Г1п(-№ЩЕ1).
В положении равновесия
{Продукты]
[Субстраты]
--К' и Д(?=О
(т. е. при равновесии не происходит изменений свободной энергии). Следовательно,
; AG°=—RT In К'.
Например, в случае фосфофруктокиназной (ФФК) реакции значение AG° было рассчитано из комбинации стандартной свободной энергии гидролиза АТФ и (рассчитанной косвенным путем) стандартной свободной энергии образования фруктозо-6-фосфата и фруктозодифосфата в водных растворах [22]. Значение AG° для .ФФК реакции равно —4,2 ккал/моль.
Так как AG°=—RTlnK', то
—4200=—1,98- 310- 2,303jg К',
kK'eWe2*974-
K'= 940 при pH 7,0 и температуре 37 °С.
Таким образом, значение кажущейся константы равновесия ФФК при 37 °С и pH 7,0 составляет около 103.
Определение тепловых эффектов реакций с участием биологических соединений часто бывает затруднено тем обстоятельством, что для такого изменения температуры, которое можно точно измерить, требуются огромные количества этих соединений. Появление микрокалориметрического метода (позволяющего измерять- изменения температуры порядка 10_6°С) в будущем, без сомнения, исправит это положение.
Микрокалориметрический метод дает возможность рассчитывать константу равновесия непосредственно из количества тепла, высвобождаемого (Qi), когда равновесие достигается добавлением фермента к субстрату, и из количества поглощаемого тепла (—-Q2), когда равновесие достигается добавлением фермента к продукту. В каждом случае отношение Qi/AH или —Q2IAH представляет долю субстрата, превращенного в продукт в момент достижения равновесия. Следовательно,
гsr Qi/AH Qi
~ -Qa/АЯ — Qa *
Таким образом, константа равновесия может быть найдена из результатов только двух измерений тепловых эффектов в разведенном растворе (см., например, работу [23]).
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.2.
ИЗМЕРЕНИЕ ОТНОШЕНИИ ДЕЙСТВУЮЩИХ МАСС
Практическое измерение отношения действующих масс следует производить на интактном в физиологическом отношении тканевом препарате. Это могут быть целые клетки (например, дрожжевые клетки или клетки асцитной опухоли), перфузи-руемые препараты (например, мышца или печень), инкубируемые препараты тканевых срезов (например, корковое вещество почек или кора мозга) или ткани in situ (например, печень анестезированного животного). На первом этапе производят быстрое (насколько это возможно) замораживание препаратов, для того чтобы остановить одновременно все ферментативные реакции и сохранить концентрации всех метаболических интермедиатов на уровне, характерном для нормально функционирующей ткани. Это достигается с помощью метода замораживания — сдавливания; препарат быстро сдавливают между двумя большими аллюминиевыми пластинами, охлажденными предварительно до температуры жидкого азота (—190 °С). Необходимость в такой процедуре связана
с тем, что скорость замораживания брошенных в жидкий азот кусочков ткани поразительно низка. Измерения, проведенные с помощью термопары, помещенной в желудочек сердца морской свинки на глубину 1 мм, показали, что время охлаждения ткани в таких условиях от 37 до 0°С составляет 16 с [24]. При охлаждении ткани образуется пузырь газообразного азота, который окружает ткань и таким образом частично изолирует ее от жидкого азота. Такой изоляции не происходит при использовании аллюминиевого зажима, в котором ткань охлаждается от 37 до — 80 °С быстрее чем за 0,1 с. После замораживания— сдавливания ткань должна быть быстро и при низкой температуре депротеинизирована. Это достигается измельчением замороженной ткани до порошкообразного состояния при температурах значительно ниже точки замерзания (например, :—70 °С) и смешиванием тканевого порошка с замороженным денатурирующим агентом (например, с хлорной кислотой). При оттаивании порошка происходит почти мгновенная инактивация ферментов и образуется белковый осадок, который может быть удален центрифугированием. Надосадочную фракцию нейтрализуют и анализируют на содержание метаболитов с помощью специфических ферментативных тестов. Преимущество ферментативного анализа состоит в том, что он позволяет с высокой точностью и специфичностью измерить содержание индивидуальных метаболитов в составе сложной биологической смеси, минуя утомительную и трудоемкую процедуру разделения.
