Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.
Скачать (прямая ссылка):
Химические реакции расщепления ДНК
В настоящей прописи предлагается классический вариант метода Максама-Гилберта (Maxam, Gilbert, 1980) с модифика-
секвенирование ДНК
42
циями, сделанными в основном сотрудником ИМБ (Москва)
А.С.Краевым. Метод может быть использован для определения первичной структуры ДНК однонитевых или двунитевых фрагментов различных размеров, включая и олигонуклеотиды. Все реакции проводят в пробирках "эппендорф", осадки получают на центрифуге 5414 этой же фирмы.
1. Четыре пробирки "эппендорф" подпишите следующим образом: "G", "G+A", "С+Т", "С".
2. ^2Р фрагмент ДНК, растворенный в 20 мкл н20 распределите по пробиркам следующим образом:
nGn "G+A” ”С+ТИ "Т"
4 мнл 5 мкл 7 мкл 4 мкл
3. Пробирки поместите в лед. Все реагенты добавьте на льду. Химические реакции проводите при 15-21°С, поместив пробирки в водяной термостат.
Химические реакции
Реакция по цитозину-"С"
В пробирку "С" добавьте 8 мкл 5 М HaCi, перемешайте и добавьте 15 мкл безводного гидразина (HZ)1.
Реакция по тимину и цитозину - "Т+С"
В пробирку *?+С" добавьте 10 мкл безводного гидразина.
Реакция по гуанину и аденину - "G+A"
В пробирку "G+A" добавьте 10 мкл муравьиной кислоты.
Реакция по гуанину - "G"
В пробирку "G" добавьте 100 мкл буфера: 50 мМ какодилат
8,0, I мМ ЭДТА и I мкл диметилсульфата.
1 Получение безводного гидразина может быть организовано в kTMK ИЩГ при наличиии на него спроса.
секвестрование ДНК
43
Продолжительность химических реакций (мин).
га
• G
A+G
Т+С
С
30
10
25
50 100
и менее
300
I 2,5
5 10
При длине фрагмента ДНК более 300 пн реакцию по G проводят при 0°С.
Остановка реакций "С" и "С+Т”
1. После окончания реакции пробирки поместите на 2 мин в ледяную воду.
2. Добавьте в каждую пробирку по 150 мкл 0,3 М ЕГаАц pH
7,0, энергично встряхните и добавьте по 2 мкл tPHK (2,5 мг/мл) и по 500 мкл этанола, перемешайте и сразу же центрифугируйте 5 мин. Супернатант слейте.
3. К осадкам добавьте 100 мкл 0,3 М ЫаАд pH 7,0 и 500 мкл этанола, центрифугируйте 5 мин, супернатант слейте,
4. К осадкам добавьте 500 мкл этанола и, не перемешивая осадки, центрифугируйте I мин. Спирт слейте, осадки подсушите под вакуумом.
Примечание. Растворы и посуду, загрязненные гидразином, следует сбрасывать в раствор 3 М FeCi,, диметилсульфатом -в 5 М NaOH.
"G" И "A+G"
I. Добавьте в пробирку "G" 12 мкл 3 М НаАц pH 7,0, а в пробирку "A+G" 150 мкл 0,3 И ЯаАц pH 7,0, затем в обе
пробирки по 2 мкл tFHK (2,5 мг/мл) и по 500 мкл этано-
секвенирование ДНК_____________44
ла.Перемешайте и центрифугируйте 5 мин. Супернатант слейте.
2. К осадку добавьте 500 мкл этанола и, не перемешивая осадок, центрифугируйте I мин. Осадки подсушите под вакуумом.
Расщепление ДНК по модифицированным основаниям
1. К осадкам добавьте по 100 мкл 10% свежеприготовленного раствора пиперидина и прогрейте все пробирки на кипящей водяной бане в течение 30-45 мин. При этом крышки всех пробирок должны быть плотно закрыты.
2. Поместите пробирки в ледяную воду. Добавьте в кавдую пробирку по 30 мкл 3 М ЯаДц pH 7,0, 2 мкл tFHK (2,5 мг/мл) и 650 мкл этанола. Перемешайте и центрифугируйте 5 мин.
3. Растворите осадки в 100 мкл 0,3 М НаАц pH 7,0, прибавьте 500 мкл этанола, перемешайте и центрифугируйте 5 мин.
4. Осадки промойте I мл этанола, центрифугируйте I мин и подсушите под вакуумом.
5. Осадки растворите в 3-9 мкл деионизованного формамида, содержащего по 0,02% бромфенолового синего и ксиленциа-нола, вцдержите образцы на кипящей водяной бане 2 мин
и сразу же нанесите на полиакриламидный гель, содержащий 8 Ы мочевину. Обычно наносят до 3 мкл на старт 6x0,4
секвестрование ДНК______________45
П. Определение первичной структуры ДНК методом Максама-Гилберта с использованием ацетонового осаждения
А. Электроэлюция ДНК из полиакриламидного геля
1. Полоску полиакриламидного геля, содержащую меченный фрагмент ДНК после препаративного электрофореза, поместите в камеру для электроэлюции, залейте в камеру буфер ТЕЕ и 100 мкг тРНК-носителя.
2. Перенос проводите на диализную мембрану электрофорезом при токе 5-10 ма на одну элюционную камеру. Контроль переноса осуществляйте по уменьшению радиоактивности полоски геля с помощью счетчика радиоактивности.
3. По окончании переноса отберите буфер из камеры пипеткой, оставив в отсеке у "+" электрода около I мл. Осторожно удалите верхний слой буфера, оставив примерно 200 мкл поверх мембраны, и перенесите в чистую пробирку. Оставшимся буфером тщательно промойте мембрану и перенесите его в другую чистую пробирку. Затем снимите мембрану и несколько раз прополоскайте ее внутреннюю поверхность буфером, перенесенным в первую пробирку. Остатками того же буфера промойте "+" отсек элюционной камеры.
