Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 4.3. Буферные растворы для электрофореза
Трис-цнтратпый буфер (ТЦ) Рабочий раствор
Трис 17 г
Лимонная кислота (моногидрат) 9,1 г
Дистиллированная вода 1000 мл
pH 7,1
Трнс-ЭДТА-боратный буфер (ТЭБ) 5-кратиый концентрат
Трис 109,0 г
ЭДТА-Nas 7,6 г
Борная кислота 6,2 г
Дистиллированная вода 1000 мл
pH 8,6
Буфер для геля: 50 мл однократного концентрированного буфера+450 мл Н20
Буфер для камеры: однократный концентрированный буфер
Таблица 4.4. Процедуры для выявления ЛД, ГФД и НФ1}
Ферментная Электродный Буфер геля Окрашивающий раствор2)
система буфер
ЛД тц тц (0,1Х) Н20 (10 мл)
0,5 М трис pH 7,5 (5 мл)
1,0 М лактат натрия (5 мл)
NAD3> (10 нг/мл) (5 мл)
МТДТ3> (5 мг)
ТЭБ' ФМС3> (2 мг)
ГФД ТЭБ (0,1Х) Н20 (5 мл)
0,5 М трис pH 7,5 (5 мл)
0,025 М глюкозо-6-фосфат
(5 мл)
0,1 М MgCl2-6H20 (5 мл)
0,005 М NADP3» (5 мл)
МТДТ3> (5 мг)
ФМС3> (2 мг)
НФ ТЭБ ТЭБ (0,2Х) Н20 (20 мл)
0,1 М NaH2P04-H20 (5 мл)
Инозии (50 мл)
Ксантииоксидаза4) (100 мкл)
МТДТ3> (5 мг)
ФМС3> (2 мг)
*) Во всех гелях разделение идет в течение 16—18 ч при 4 °С и градиенте напряжения 4—5 В/см (160—180 В), NADP (5 мл в концентрации 0,005 М) добавляется к катодному буферу н к окрашивающему раствору при анализе ГФД.
2) Эти концентрированные растворы смешиваются непосредственно перед использованием с равным объемом (25 мл) 2%-ной водной суспензии агара, после чего смесь разжижается и охлаждается до 45—50 °С.
а) NAD — иикотинамнддннуклеотид; NADP — NAD-фосфат; МТДТ — днметилтиазол-дифеиилтетразолий; ФМС — феназинметосульфат.
4) Концентрация 100 мг/мл; добавлять непосредственно перед смешиванием с агаром.
го можно достигнуть, используя кипящую водяную баню, горячую мешалку и вакуумный или микроволновый нагревательный шкаф. Перемешивание должно быть постоянным, чтобы избежать образования комков и пригорания.
II. Поместите в вакуум на 60 с для удаления пузырьков воздуха и медленно и равномерно охладите до 60 °С при слабом помешивании.
III. Для систем ЛД и ГФД добавьте на этом этапе NADP и осторожно, но тщательно перемешайте.
IV. Перенесите крахмал в форму для геля, руководствуясь инструкциями изготовителей, и дайте остыть в течение 2•— 3 ч при комнатной температуре, избегая толчков. В лаборатории автора используется аппарат Бачлера для вертикального электрофореза в геле (Buchler Instruments Inc., Fort Lee, New Jersey).
Рекомендуется следующий порядок проведения электрофореза:
I. Разморозьте экстракт клеток и центрифугируйте на микроцентрифуге в течение 1—2 мин.
II. Осторожно удалите гребенку с 10 ячейками из формы для геля, руководствуясь инструкциями изготовителей, и добавьте в каждую ячейку 0,03—0,04 мл экстракта, используя тонко оттянутую пастеровскую пипетку или шприц с
Рис. 4.4. Зимограммы изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛД), глюкозоб-фосфат дегидрогеназы (ГФД) н нуклеозндфосфорилазы (НФ), показывающие типичное расположение полос в препаратах линий клеток наиболее часто используемых видов.
иглой калибра 26. Не допускайте попадания избытка экстракта в соседние ячейки.
III. Покройте всю поверхность геля, обнажившуюся при удалении гребенки, нагретым керосином.
IV. Добавьте буфер в электродные камеры и установите форму для геля на место с помощью удерживающей пружины (см. описание прибора).
V. Приложите матерчатые тампоны, установите прибор в помещении при 4°С и начните разделение, используя градиент напряжения на пластине геля 4—5 В/см.
Рекомендуется следующий порядок обнаружения изоферментов:
I. Выньте пластинку геля из формы, удалите по 5 см с обоих концов и разрежьте гель горизонтально на три иден-
тичные части, используя специальное приспособление для разрезания геля (см. описание фирмы-изготовителя).
II. Разделите три слоя и уложите в ванночки для окрашивания.
III. Покройте всю поверхность геля смесью агара с соответствующим красителем и инкубируйте при 37°С в темноте. Полосы начнут появляться через 1—3 ч в зависимости от типа фермента и активности экстракта.
