Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
ручек и стандартных лабораторных маркеров нежелательно, особенно в случае стеклянных ампул. Последние нужно надписывать керамическими чернилами, которые могут быть отожжены на поверхности ампул. Надписывать можно от руки ручкой с пером, а в случае крупных партий ампул можно использовать механический отметчик (например, выпускаемый фирмой Маг-кеш Co., Keene, New Hampshire).
Запаивать ампулы лучше всего путем оттягивания их шеек, когда они вращаются в наиболее горячей зоне пламени от га-зо-кислородной горелки. Техника запаивания оттягиванием считается более надежной, поскольку в этом случае снижается риск образования капиллярных каналов в запаянном кончике. Горелку для ручного запаивания можно приобрести в магазине
научного обрудования. Для запаивания больших партий ампул горелку можно присоединить к полуавтоматическому устройству для запаивания (рис. 4.2), поставляемому фирмой Morgan Sheet Metal Co., Sarasota, FL, USA, под названием запаива-тель Bench, модель 161.
3.1.2. Аппараты для медленного замораживания
Оптимальная скорость замораживания клеточных линий (обычно около —1°/мин) может быть достигнута при использовании оборудования разной сложности, начиная от специально приспособленного ящика из пенопласта и кончая полностью программируемым морозильным блоком. Ящик из пенопласта должен иметь толщину стенок около 2 см, чтобы добиться скорости охлаждения 1°/мин при помещении в механический морозильник с температурой —70 °С. Фирмы, производящие рефрижераторы с жидким азотом, предлагают за умеренную цену приставку к рефрижератору, с помощью которой можно медленно заморозить небольшую партию (1—9) ампул. Для тех, кто замораживает более крупные партии ампул или нуждается в более точном контроле скорости замораживания, можно рекомендовать морозильные блоки с постоянной или программируемой скоростью замораживания (Cryo-Med; Planer; Union Carbide).
3.1.3. Холодильники с жидким азотом
Выбор того или иного холодильника производится на основе экономических расчетов с учетом расходования жидкого азота, начальных затрат, желаемой емкости хранилища и удобства закладки материала и его извлечения. Морозильники с наиболее узкими входными отверстиями, как правило, наиболее экономичны. Некоторые более крупные установки снабжены подъемной площадкой для упрощения операций.
Ампулы с клетками можно хранить в жидком азоте либо в его парах. Последний метод удобнее, так как, если у ампул остаются капиллярные проходы, они не заполняются жидким азотом, и тем самым ликвидируется опасность взрыва при размораживании. Несколько более высокая температура паров азота не является, по-видимому, отрицательным фактором, за исключением, может быть, случаев длительного хранения запаса клеток, предназначенного для рассева.
Полезными дополнительными устройствами для холодильников являются роликовые опоры для удобства перемещения, системы сигнализации для оповещения об угрожающе низком уровне жидкого азота, а также системы укладывания ампул (у более крупных рефрижераторов) для облегчения их хране-
ния и извлечения. Даже при наличии автоматических систем контроля следует регулярно вручную проверять уровень жидкого азота с помощью погружного щупа/Электронная система может отказать — такое случается и с Системой автоматического заполнения, и с дублирующей системой оповещения.
3.2. Подготовка и замораживание
Для замораживания следует отбирать культуры на поздней логарифмической или предконфлюентной фазах роста, поскольку именно в таких культурах клетки наиболее жизнеспособны. В случае необходимости культуру обрабатывают трипсином для получения однородной суспензии одиночных клеток, как и в случае обычного пересева, и далее проводятся следующие операции:
I. Непосредственно перед использованием подготовьте среду для заморозки путем простого смешивания свежей ростовой среды с выбранным криопротектором. Концентрация криопротектора слабо зависит от типа клеток и природы криопротектора и обычно используется в диапазоне от 5 до 10% по объему.
II. Осадите клетки центрифугированием при 200 g в течение 10 мин и ресуспендируйте осадок в нужном объеме среды для заморозки при комнатной температуре. Наиболее удобно доводить концентрацию клеток до 106—107 клеток/мл, но в некоторых случаях эту величину приходится на порядок снижать или увеличивать.
III. Если общий объем суспензии велик (например, при препаративном замораживании), поддерживайте клетки в суспензии мягким перемешиванием в подходящем сосуде, снабженном автоматическим шприцем Корнуэлл. Если клетки суспендированы в небольшом объеме (10—20 мл), используйте шприц с иглой калибра 18 или канюлей. В течение всего процесса постоянно встряхивайте суспензию.
IV. При необходимости поддерживайте pH суспензии, пропуская через нее смесь водонасыщенного воздуха с СОг.
V. Разлейте клеточную суспензию (по 1 мл) по ампулам. Это нужно делать быстро, так как клетки в шприце Корнуэлла быстро оседают под действием силы тяжести; чтобы в ампулах получились суспензии одинаковой плотности, необходимо проводить разлив быстро и ритмично.
