Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Было высказано предположение, что кальций защищает клеточные функции от воздействия тепла и что поглощение кальция клетками В. stearothermophilus — необходимое условие их роста при повышенных температурах (Stahl, Ljunger, 1976). За исключением внеклеточных.ферментов, таких, как термолизин и си-амилаза, нам не известны другие ферменты, обнаруживающие абсолютную потребность в кальции для проявления термоста-бильности. Хотя присутствие прочно связанного Са2+ могло остаться иевыявлениым, Барнес и Стеллвейджен (Barnes, Stellwa-gen, 1973) с помощью элементарного и колориметрического анализов показали, что на термостабильность знолазы из Thermus Х-1 не оказывают влияния какие-либо ионы металлов. Точно так же при выделении и определении активности кристаллических ГФДГ обычно используется 10~3 М раствор ЭДТА, не вызывающий какого-либо заметного подавления активности ферментов.
Г. ФОРМИЛТЕТРАГИДРОФОЛАТ-СИНТЕТАЗА
1. Введение
Формилтетрагидрофолат-синтетаза катализирует синтез 10:формилтетрагидрофолата из муравьиной кислоты, тетрагидрофолата и АТР. Фермент выделен и очищен из печени голубя
(Greenberg et al., 1955), M. aerogenes (Whiteley et al., 1959), C. acidi-urici и С. cylindrosporutn (Rabinowitz, Pricer, 1962), C. thermoaceticum (Sun et al., 1969; Ljungdahl et al., 1970) и
С. formicoaceticum (O’Brien et al., 1976). Фермент из облигатного термофила С. thermoaceticum (Himes, Wilder, 1968; Ljungdahl, Wood, 1969) так же, как и фермент из мезофила С. formicoaceticum (O’Brien, Ljungdahl, 1972), включает СО2 в 5-метиль-ную группу 5-метилтетрагидрофолата, который затем карбокси-лируется в ацетат (Rabinowitz, Pricer, 1957; Ljungdahl, Wood,
1969). Опубликованы сравнительные данные о свойствах синтетазы из различных клостридиев (Himes, Harmony, 1973; O’Brien et al., 1976).
2. Термостабильность
Была проведена оценка термостабильности формилтетрагид-рофолат-синтетазы при различных экспериментальных условиях (Ljungdahl et al., 1970). Проверено влияние на фермент одновалентных катионов в процессе его инкубации при различных значениях pH в течение 30 мин при температуре 60°С. В качестве растворителя во всех случаях использовали 0,05 М трис-НС1 (рн 7,5). 0,01 М NH4CI и 0,01 М КСЛ стабилизировали фермент в большей степени, чем 0,01 М NaCl или буфер сам по себе. Однако через 30 мин инкубации при 60°С во всех пробах обнаружилась значительная инактивация фермента, за исключением пробы, где присутствовал NH4C1. В тех же условиях, но при снижении pH до 7,0 фермент проявлял достаточную стабильность в течение 30-минутного периода. В 0,01 М буфере трис-малеат без добавок фермент был стабилен при 50°С в интервале pH 6,0— 8,5, но при 5,5 и 8,9 наблюдалось медленное снижение его активности: при 60°С инактивация наступала при любом pH. Однако если в буфере трис-малеат присутствовал КС1, то инактивация фермента при 60°С в интервале pH 6,8—9,0 протекала очень медленно, аналогично его инактивации при 50°С в одном буфере без добавок. По-видимому, ионы калия увеличивают термостабильность синтетазы в интервале pH 6,8—9,0, но при pH ниже 6,8 наступает быстрая инактивация фермента. Хотя ионы и оказывают влияние на термостабильность, они не вызывают увеличения активности фермента.
Несмотря на то что термофильная синтетаза обнаружила большую термостабильность, чем ее мезофильный аналог, это различие выражено у нее не столь заметно, как у многих других термофильных ферментов.
3. Физико-химические свойства
Формилтетрагидрофолат-синтетаза была охарактеризована в физико-химическом отношении (Brewer et al., 1970). Недавно было проведено детальное сравнение этого фермента, выделенного из _ С. thermoaceticum и трех мезофильных клостридиев (O’Brien et al., 1976). Во всех случаях оказались очень сходными такие параметры, как аминокислотный состав, молекулярный вес, S°2oiW, F, ///о и максимум испускания флуоресценции. Хотя все ферменты, выделенные из указанных источников, имеют одинаковый молекулярный вес, равный 240 ООО, ферменты, полученные из мезофилов, в отличие от фермента из термофила нуждаются для проявления активности в ионах калия или аммония,, причем удаление этих ионов приводит к диссоциации ферментов-на субъединицы (MacKenzie, Rabinowitz, 1971; Welch et al.,
1971). Синтетаза из С. thermoaceticum не диссоциирует после удаления моновалентных катионов. Величины Км для ферментов из всех источников практически одинаковы (O’Brien et al.,. 1976). Однако в случае синтетазы из С. cylindrosporum кривая зависимости Км от температуры имеет перегиб при температуре около 30°С (Himes, Harmony, 1973), тогда как у термофильного фермента такой перегиб наблюдается при температуре около 45°С (Ljungdahl, Sherod, 1976). На графике Аррениуса, построенном для термофильного фермента, также имеется перегиб кривой при температуре около 45°С. Хотя кинетические данные говорят о наличии в молекуле фермента конфирмационного изменения, при измерении оптического вращения белка оно не было обнаружено. Перегиб, наблюдаемый при 45°С на кривой зависимости оптической плотности белка при 295 нм от температуры (Shoof et al., 1974), подтверждает возможность небольшого кон-формационного изменения молекулы белка.
