Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
Нередко наблюдаются и другие, заметно меньшие значения.
При специфическом включении метки можно получить разнообразную информацию
о структуре. Обычно выбирают такую метку, чтобы возбуждающий свет
поглощался только ею (но не макромолекулой). В этом случае макромолекула
остается "невидимой", и вся информация относится к метке. В табл. 8.3
суммированы свойства нескольких наиболее часто используемых
флуоресцентных меток (рис. 8.16). Заметим, что относительная
экспериментальная чувствительность (?тахФр)> приведенная в таблице,
значительно превышает соответствующую величину для большинства
собственных хромофоров белков и нуклеиновых кислот.
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХРОМОФОРА К ОКРУЖЕНИЮ
Флуоресценция, как правило, гораздо более чувствительна к окружению
хромофора, чем поглощение, и это позволяет с успехом использовать ее для
изучения связывания ли-
РИС.. 8.15. Нормированные спектры флуоресценции, полученные при
возбуждении светом с X = 240 - 250 нм сывороточного альбумина человека
(/), триптофана (II), смеси тирозина и триптофана в молярном отношении
18:1 (кривая III). Такое же соотношение между этими аминокислотами имеет
место и в сывороточном альбумине. Отметим, что спектр этого белка очень
напоминает спектр триптофана, если не считать, что последний сдвинут в
сторону больших длин волн. (J.W. Longworth. In: Excited States of
Proteins and Nucleic Acids ed. R.F. Steiner, I.Weinryb, New York, Plenum
Press, 1971.)
X ,им
S02Cl Дансилхлорид
/(CH2)2-NH-CO-CHZI
N
1,5-I-AEDANS
N-C=S
ANS
Пирсы
Рибоза
Этеноаденозин
Бромистый
этидий
NH-СО-NH-NH2
Профлавинмоносемикарбазид
РИС. 8.16. Структурные формулы флуоресцентных меток, свойства которых
описаны в табл. 8.3.
96
ГЛАВА 8
ь
г
S
X , им
РИС. 8.17. Спектры возбуждения свободного бромистого этидия в водном
растворе (штриховые кривые) и этого же красителя, связанного с
двухцепочечной ДНК (А) и с РНК (Б) (сплошные кривые). Испускание
регистрировалось при 600 нм. (По рисунку, предоставленному ЛеПеком и Пао-
летти.)
гандов или для выявления конформационных изменений. Более высокая
чувствительность флуоресценции объясняется тем, что молекула довольно
долго находится в возбужденном состоянии, прежде чем произойдет ее
дезактивация. Поглощение совершается за время порядка 10"15 с (эти же
времена характерны и для КД), и можно считать, что свойства молекулы и ее
окружения не успевают измениться. Напротив, за время жизни синглетного
возбужденного состояния, 10~9-10-8 с, могут произойти разные события -
протонирование или депротонирование, релаксация окружающих молекул
растворителя, локальные конформационные изменения и разнообразные
процессы, связанные с поступательным и вращательным движением.
Целый ряд флуоресцирующих молекул обладает очень интересным свойством- в
водных растворах наблюдается практически полное тушение их флуоресценции,
зато в неполярном или жестком окружении интенсивность флуоресценции
существенно возрастает (в 20 и более раз). Если флуоресцентная метка
связывается с жестким или неполярным участком молекулы белка или
нуклеиновой кислоты, то спектр флуоресценции определяется в основном
меткой, находящейся в связанном состоянии. На рис. 8.17 приведен типичный
пример такого рода. В случае белков среди меток, чувствительных к
окружению, чаще всего используется краситель 8-анилинонафтилсульфонат,
для нуклеиновых кислот такой меткой является этидий. В водных растворах
этот краситель флуоресцирует очень слабо, но при встраивании в
двухцепочечные участки нуклеиновых кислот интенсивность его флуоресценции
резко возрастает. При фиксированной суммарной концентрации флуоресцентной
метки изменение числа центров связывания или прочности связи приводит к
существенным изменениям в наблюдаемой флуоресценции, что позволяет
проводить прецизионные исследования разнообразных интересных явлений.
Еще одним аспектом влияния окружения на флуоресценцию хромофора является
доступность последнего для молекул тушителя, находящихся в растворе.
Основное состояние кислорода - триплетное. Столкновение его с молекулой,
находящейся в возбужденном синглетном состоянии, приводит к увеличению
вероятности синглет-триплетного перехода и, таким образом, к тушению
флуоресценции. Аналогичное действие оказывают и тяжелые атомы (например,
ионы цезия или иода), хотя механизм тушения здесь иной. Свободный
хромофор в водном растворе очень чувствителен к такого рода тушению, а
будучи связанным с макромолекулой, он может оказаться в значительной мере
экранированным от растворителя, т.е. защищенным от молекул-тушителей.
Измеряя зависимость
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
97
интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в принципе можно
различить остатки, находящиеся на поверхности белковой молекулы и внутри
ее. Часто эти различия оказываются замаскированными из-за сложного
влияния локального окружения. Например, анионные группы, находящиеся
поблизости от хромофора, могут мешать отрицательно заряженным ионам
