Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
474 Глава 9
рошо воспроизводимые результаты. В работе [64] описана идентификация
природных модифицированных адениннуклеозидов (и З'-О-метиладенозина) при
помощи ВЭЖХ, условия проведения которой подобраны так, чтобы сделать
возможным разделение большинства нуклеозидов. В основу идентификации
положен метод ферментативного сдвига пика: определяется время удерживания
и пробы, и продукта Ы6-дезаминирования, полученного после инкубирования
пробы с ферментом аденозиндез-аминазой.
9.3.6. 5-Фторурацил и 5-фтор-2'-дезоксиуридин
Биохимическая роль 5-фторурацила и его нуклеозидов и нуклеотидов освещена
в обзоре [65]. Для разделения 5-фторурацила, его дезоксирибо- и
рибонуклеозидов и нуклеотидов используется жидкостная обращенно-фазовая
хроматография [66]. Основания и нуклеозиды легко отделяются от их
природных аналогов на ODS-фазе при элюировании 20 мМ К.Н2РО4 (pH 5,0),
содержащим 5 об. % метанола. Этот метод пригоден для определения 5-фтор-
2'-дезоксиуридина в сыворотке крови, где его концентрация составляет
примерно 0,1 мкг/мл. Добавки в элюент небольших количеств
тетрабутиламмонийфосфата (10_3 М) приводят к значительному увеличению
времени удерживания нуклеотидов, тогда как коэффициенты емкости оснований
и нуклеозидов остаются неизменными. Исследование влияния концентрации
тетрабутиламмонийфосфата и аммонийфосфата, а также pH элюента показало,
что четвертичные аммониевые основания абсорбируются силикагелем с
привитыми октаде-цильными группами, а нуклеотиды, вероятно, удерживаются
в результате образования ионных пар с тетрабутиламмониевыми ионами.
В работах [67-71] описаны методы контроля с использованием ВЭЖХ за
содержанием 5-фторурацила в плазме на уровне микромолярных и более
высоких концентраций. Хотя приведенные методы отличаются от предложенных
ранее микробиологических или газохроматографических методов большей
чувствительностью и (или) специфичностью, тем не менее пригодность их для
фармакокинетических исследований (предусматривающих контроль концентраций
5-фторурацила) ограничена, если необходимы такие процедуры, как
непрерывное внутривенное вливание, вливание в печеночную артерию,
перитонеальный диализ. В таких случаях точный контроль за концентрацией
лекарственных средств необходимо вести в диапазоне 0,1-1,0 М.
Известен специфический и чувствительный метод определения с помощью
ВЭЖХ 5-фторураиила и 5-фтордезоксиуридина в плазме крови человека в
концентрации около 50 нМ [27]. В качестве внутренних стандартов в этом
методе используют
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 475
тритий-меченые 5-фторурацил и 5-фтордезоксиуридин. Фторпи-римидины
выделяют из плазмы крови с помощью анионообменной хроматографии и
экстрагируют этилацетатом, экстракт упаривают досуха и 5-фторурацил и 5-
фтордезоксиуридин разделяют на полупрепаративной колонке (бондапак Ci8).
Метод является специфичным и достаточно чувствительным для определения
концентраций 5-фторурацила в плазме, меньших чем
1 мкМ (для таких ситуаций, когда проводятся вливание в печеночную артерию
или перитонеальный диализ).
9.4. Разделение олиго- и полинуклеотидов
9.4.1. Олигонуклеотиды
Тринуклеозиддифосфаты являются ценным средством исследования процессов
биосинтеза белков. Их применяли при расшифровке генетического кода, для
исследования вторичной структуры тРНК и 5S-pPHK, а также для изучения
специфичности связывания олигонуклеотидов с фактором инициирования
трансляции IF3. Тринуклеозиддифосфаты были получены путем ферментативного
синтеза и по традиции выделены с помощью анионообменной хроматографии.
Процедура выделения обычно состояла из элюирования в течение ночи в
градиенте концентрации соли с последующим вымыванием соли в течение еще
одного дня. Для того, чтобы упростить методику и сократить время
выделения, было предложено использовать обращенно-фазовую хроматографию
на пористом микрогранулированном силикагеле с привитыми ODS-группами
депротеинизированных реакционных смесей при элюировании в градиенте с
увеличивающейся концентрацией метанола [73]. Применение этого метода
позволило полностью отделить все 16 нуклеозидмонофос-фатов друг от друга,
а также от тринуклеозиддифосфатов и побочных продуктов синтеза.
Олигоаденилаты, отличающиеся по типу З'-конца (АПА, АпАр и АпА>р,
олигоаденилаты, не имеющие фосфатной группы на З'-конце, 2', З'-
монофосфаты и 2', З'-циклические фосфаты), разделяют методом ВЭЖХ на
колонке с RPC5, а в последнее время на сдвоенных колонках [74]. На первой
из них происходит отделение АПАР и АпА>р от АПА, далее в верхней части
второй колонки смесь проходит через слой, содержащий бактериальную
щелочную фосфатазу, осуществляющую конверсию АПАР в АпА. Следовательно,
АпА выходит отдельно от исходных АпА и АПА>р. Метод может быть
использован для определения состава трехкомпонентной смеси, имеющей
компоненты с одинаковой длиной цепи, или смеси компонентов с разной
длиной цепи, когда п = 3-7 (АПАР и АпА>р). Наличие поли-(и) не влияет на
