Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
метилпсевдоуридин (ам^) обнаружен в эукариотической 18S-pPHK (D.
melanogasier). Это гипермодифициро-ванное основание полностью
останавливает процесс элонгации (удлинения) кДНК. Последовательность тРНК
ам\|) была определена с помощью дидезоксисиквенирования обратной транс-
криптазой, последовательность кДНК, кодирующая эту часть 18S-pPHK,
определена методом Максама-Гилберта. Оба этих метода в совокупности могут
быть использованы для выявления остановки (амг|з). "Химическое"
доказательство существования амг]э в этой РНК получено с помощью ВЭЖХ
нуклеозидов 18S-pPHK из радиоактивно меченных клеток [60]. L-2-[I4C]-
метионин может использоваться в качестве селективной метки ам"|) в 18S-
pPHK эукариот. Анализ с помощью ВЭЖХ позволил определить наличие
единичного 14С-меченого нуклеотида в гидролизатах 18S-pPHK. Этот
нуклеотид находится в РНК-после-довательности, несущей сигнал для
остановки синтеза кДНК, так как рестрикционный фрагмент, гибридизующийся
с этой последовательностью, предохраняет модифицированное основание от
расщепления РНКазой Т1.
9.3.4. Цитозинарабиноза и метаболиты
При осуществлении контроля за эффективностью лекарственных средств при
проведении курса лечения или исследовательских работ необходима
информация о концентрации лекарственных средств, распределении их в
тканях и устойчивости образующихся метаболитов. Такая информация
позволяет подобрать необходимые дозы лекарственных средств и их интра- и
интервариации у пациентов. l-p-D-Арабинофуранозилцитидин представляет
собой аналог пиримидинового нуклеозида и является компонентом некоторых
терапевтических наркотических препаратов. В организме A-С образует
активный метаболит А-С-три-фосфат и неактивный метаболит l-p-D-
урациларабинозид. ВЭЖХ позволяет осуществлять оперативный контроль за
содержанием A-С и его метаболитов в биологических тканях. Следует,
однако, учитывать, что хроматографическому определению
арабинозонуклеозидных аналогов в биологических объектах мешают природные
нуклеозиды и нуклеотиды. Поэтому ранее в A-С вводили радиоактивную метку
и для обнаружения после хроматографического разделения использовали
жидкостные сцинтилляционные счетчики. Метод требовал больших затрат
времени, был дорог, и, кроме того, из-за радиоактивности А-С его
применение с целью получения фармакокинетической инфор-
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды
473
мации было ограничено. Позднее были предложены два новых ВЭЖХ-метода
разделения и количественного анализа A-С и его метаболитов в
биологических тканях [61]. В одном из них изо-кратическое отделение
арабинозосодержащих аналогов от всех мешающих соединений проводилось на
анионообменной смоле аминекс, содержащей четвертичные аммониевые ионы. Во
втором методе разделение проводится на боралкилзамещенной смоле,
селективно удерживающей цитозин, уридин и другие цис-диолы и не
удерживающей арабинозопроизводные, которые затем легко разделяются
количественно на колонке с обращенной фазой Cis. Эти методы были
использованы для установления уровня лекарственных средств в сыворотке
крови и моче мышей, а также в опухолевых клетках мышей. Элюирование и в
том, и в другом случае велось в изократическом режиме, что снижало до
минимума дрейф нулевой линии и поэтому позволяло обнаруживать
нанограммовые количества A-С и его метаболитов. На анионнообменных смолах
(А-27 и А-29) проводят разделение и количественный анализ A-С, A-U и А-
СТР непосредственно в биологических тканях; процедура эта длится менее 40
мин. Количественное определение A-С и A-U проводят также на колонке с
обращенной фазой Cis после предварительной обработки препаратов
посредством аффинной хроматографии на боратзамещенном геле. Применение
обращенной фазы позволяет снизить стоимость и сократить длительность
анализа (A-С и A-U элюируются в течение 20 мин), повысить его
чувствительность. Этот метод разделения получил поэтому более широкое
распространение в клинической лабораторной практике, чем метод ИОХ.
ВЭЖХ используют для определения антинеопластического агента цитарабина
и его основного метаболита урациларабино-зида в плазме крови человека и
спинномозговой жидкости [62]. Полное отделение от эндогенных компонентов
достигается на обращенной фазе при изократическом элюировании фосфатным
буферным раствором (0,05 М, pH 7,0). Предел обнаружения составляет 50
нг/мл, относительная ошибка - менее 10%. Этот простой, оперативный и
селективный метод, как показали исследовании, пригоден и для
фармакокинетических исследований и осуществления клинического контроля.
9.3.5. Модифицированные адениннуклеозиды
В работе [63] опубликован быстрый, чувствительный и специфический метод
определения б'-метилтиоаденозина в биологических пробах. Разделению проб
на партисиле 10 SCX предшествует их двухстадийная хроматографическая
обработка на дауэксе-50 (Н+-форма) и геле борной кислоты. Выход
соединения количественный, методика разделения проста и дает хо-
