Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
лимонная кислота (pH 2,50)+3 об. % н-пропанола+0,125 М
ЫаСЮ,+додецилсульфат натрия (0,03%); температура: 25°С (аналогично
[148]). 3-M-Tyrm - 3-метокснтирамин; Тугт - тирамин:
3-H-Tyrm - дофамин; Isopren - изопрен; МН - метанефрин; NM -
норметанефрин; Syn- синефрни; Dopa - 3.4-дигндрокснфенИлаланни; NSyn -
норсивефрин; Е - эпннефрин; NE - норэпннефрнн; HVA - гомованнлнновая
кислота; 5-ШАА- 5-гндроксннндолил-З-ук-сусная кнелота; DOPAC - 3.4-
днгидроксифеинл-уксуоиая кислота; HGA - 2.5-Днгидроксн-феннл-уксусиая
кнелота; VMA - ваннлнлмнндальиая кнелота; DOMA - дигидроксичин-дальиая
кислота.
зать можно. Увеличение концентрации противоионов (Na+) или ПАВ приводит к
увеличению коэффициента емкости k для соединений с основными свойствами.
Зависимость величины k от концентрации ПАВ в системе с анионогенным ПАВ
имеет такой же характер, что и в анионообменной системе с катионогенным
ПАВ (например, при разделении сульфоновых кислот в присутствии
цетилтриметиламмонийбромида [157]).
Эффективность разделения более всего повышают ацетонитрил и метанол,
тогда как н-пропанол способствует стабильности работы колонки [148].
Увеличение концентрации кислоты в элюенте снижает время удерживания и
несколько увеличивает число теоретических тарелок, а добавление
органического модификатора повышает скорость разделения, однако
одновременно вызывает некоторое уменьшение числа теоретических тарелок. К
сожалению, из-за
Биогенные амины 369
Рис. 6.10. Разделение стандартной смеси катехоламинов н их метаболитов в
нзократнческнх условиях в динамической катиоиообменной системе.
Колонка: Св-прийитый снлохром; элюент: 0,02 М лимонная кислота <рН 2.50)
+ 1 об. я*пропаиола+0,2 М NaC104+0,3% додецнлсульфата натрия;
температура: 25 °С (аналогично [481)•
/ - 3,4*дигидроксиминдальная кислота; 2 - ваннлилмиидальная кислота; 3 -
2,5-дигидро-ксифеинлуксусная кислота; 4 - 3,4-дигидрокснфеиилуксусиая
кислота; 5 - 5-гидроксинн-дол-3-уксусная кислота; 6 - гомоваиилиновая
кислота; 7 - адреналин; 8 - норадреиалин: 9 - норсииефрпи; 10 - еинефрии.
И - 3,4-днгидроксифеннлалаиии; 12 - норметаиефрни; 13 - метаиефрин; 14 -
дофамни; 15 - тирамии; 16 - 3-метокситирамии.
недостаточной стабильности неподвижной фазы повышать концентрацию кислоты
можно лишь до определенного предела (не более 10-2 М) и соответственно
рекомендуется избегать слишком длительного элюирования.
После оптимизации хроматографических условий разделение смесей
основных катехоламинов и их кислотных производных можно осуществить
достаточно быстро. Рис. 6.10 показывает, что катехоламины элюируются в
порядке, примерно обратном наблюдаемому для ион-парных или обращенно-
фазовых систем. Добавление в элюент додецнлсульфата натрия оказывает
положительное влияние на разделение соединений с основными свойствами и
слабо влияет на разделение кислотных компонентов. Разделение последних
лучше проводить в обращенно-фазовых системах без добавления ПАВ.
Следовательно, в каждом конкретном случае необходимо искать некое
компромиссное решение, удовлетворяющее условиям эффективного разделения
метаболитов с кислотными свойствами (чему способствует уменьшение
концентрации органического модификатора или до-децилсульфата натрия в
элюенте) и катехоламинов, обладающих основными свойствами (этому
способствует повышение концентрации додецнлсульфата натрия).
24-1489
370 Глава 6
Уменьшить концентрацию додецилсульфата натрия можно путем введения его
в неподвижную фазу и одновременного исключения из состава подвижной фазы
[148]. Это приводит к значительному увеличению времени удерживания
соединений с основными свойствами и не влияет на время удерживания
кислотных метаболитов; такой прием также увеличивает время жизни колонки.
6.4. Принципы обнаружения
6.4.1. Измерение природной флуоресценции
Катехины и индолы, как известно, обладают способностью к флуоресценции
[77, 187] или же под действием различных окислительных реагентов легко
образуют флуоресцирующие три-гидроксииндольные производные.
Хроматографические системы, в которых к ВЭЖХ-колонкам непосредственно
подсоединены флуориметрические детекторы, характеризуются высокой
селективностью, и их пределы обнаружения сравнимы с получаемыми в
системах ВЭЖХ-колон-ка/электрохимический детектор.
Обнаружение катехинов [78, 81, 189-193] и индолов [198- 196] по
природной флуоресценции стало возможным с появлением
спектрофлуориметрических детекторов для ВЭЖХ. Интерес к детекторам по
флуоресценции увеличился после того, как выяснилось, что
электрохимические детекторы недостаточно практичны и имеют нестабильные
эксплуатационные характеристики.
Флуориметрическое обнаружение позволяет повысить селективность
аналитической системы. Помимо того что относительно немногие соединения
обладают природной флуоресценцией, они еще и различаются по спектрам
возбуждения и испускания. Максимумы возбуждения катехоламинов
соответствуют 200- 220 и 280-380 нм, максимумы испускания 310-330 нм,
