Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
возможны потери.
Способность катехинов образовывать подобный комплекс с борной
кислотой положена в основу двух методов, с успехом используемых для их
группового выделения. В первом из них катехины адсорбируются на геле, к
полимерной или целлюлозной матрице которого привиты дигидроксиборильные
группы ! 102-104]. В этом случае адсорбция, промывка и элюирование
проводятся так же, как описано выше. Этот метод отличается от предыдущего
большим выходом и лучшей воспроизводимостью. Во втором случае колонку
промывают борной кислотой и удаляют катехины в виде комплексов [105]. В
обоих случаях элюаты можно ввести в ЖХ-колонку.
Определение концентрации метаболитов моноаминов в тканях мозга может
дать более надежные результаты, чем определение концентраций исходных
моноаминов. Более того, post mortem метаболиты более стабильны, чем амины
[106], и поэтому целесообразнее осуществлять анализ именно метаболитов.
Биогенные амнны 359
Рис. 6.3. Очистка метаболитов триптофана.
TRP - триптофан, 5-НТР - 5-гидро-кситрнптофан, 5-НТ - серотонин, 5-Н1АА -
5-гидроксинндол-З-уксус-
ная кислота.
катехоламинов, осущест-вляемым
методом жидкостной колоночной хроматографии, обычно рекомендуется после
осаждения белков провести экстракцию с целью группового выделения
указанных соединений. Кислые метаболиты (3,4-дигидроксифенилуксусная,
гомо-ванилиновая, 5-гидроксииндол-З-уксусная кислоты) экстрагируются
полярной органической фазой (этилацетат) при pH 2,0- 4,0. Эффективность
экстракции нейтрального метаболита
З-метокси-4-гидроксифенилгликоля не зависит от значения pH в области 1,0-
8,0. При pH 3,0 эффективность экстракции возрастает в ряду (средняя
величина±отклонение): З-метокси-4-гид-роксифенилгликоль (64±3), 3,4-
дигидроксифенилуксусная (84±4), гомованилиновая (98±4), 5-
гидроксииндолуксусная (87±3) кислоты. Проводить разделение кислотных и
нейтральных компонентов часто необязательно, и экстракты можно
непосредственно подавать на ЖХ-колонку.
Метаболиты катехина, как и метаболиты катехоламина, селективно
адсорбируются на оксиде алюминия [99-101] или на геле борной кислоты
[102-104]. Начинают обработку пробы с осаждения белков (если это
необходимо), после чего осуществляют кислотную гомогенизацию, гидролиз
сульфатных эфиров, экстракцию растворителями и в заключение проводят
адсорбцию при pH 8,6. После промывки адсорбента начинают элюирование
кислотным или метанольно-кислотным растворами. Селективность
хроматографического анализа увеличивается в результате использования
электрохимических методов обнаружения.
Подготовка к хроматографическому разделению проб, содержащих
метаболиты триптофана (серотонин, 5-гидрокситрип-тофан, 5-гидроксииндол-
З-уксусную кислоту) часто предусматривает более сложную обработку.
Хорошие результаты дает очистка на маленьких экстракционных колонках
[108]. Конкретный тип ионообменника определяется природой анализируемого
соединения. Однако желательно, чтобы выбранный ионооб-
Перед разделением метаболитов
360 Глава 6
менник позволял проводить элюирование сразу нескольких соединений.
Триптофан и 5-гидрокситриптофан выделяют на сильных катионообменниках,
например на дауэксе AQ-50, серото-ьин - на слабом катионообменнике,
например на амберлитс CG-50. 5-Гидроксииндолилуксусная кислота селективно
адсорбируется на смолах, применяемых в гель-проникающей хроматографии
(сефадекс G-10).
6.2.1.3. Предколоиочное обогащение проб серотонином и
5-гидроксииндолил-З-уксусной кислотой. Жидко-твердофазные экстракционные
колонки, используемые для предварительной очистки проб, не вполне
отвечают требованиям жидкостной хроматографии. В жидкостную
хроматографическую колонку обычно вводят всего примерно 10% того
минимального объема растворителя, который необходим для элюирования
интересующего исследователя соединения. Это означает, что примерно 90%
количества выделенного соединения теряется. В то же время если нужно
отделить серотонин и 5-гидроксииндолил-З-уксус-ную кислоту, содержащиеся
в отдельных участках головного мозга крыс или в срезах тканей головного
мозга, то необходим метод с чрезвычайно малым пределом обнаружения.
Одна из методик предварительного обогащения проб отдельных участков
головного мозга крыс серотонином или 5-гидро-ксииндолилуксусной кислотой
[109] и обогащения серотонином проб сыворотки и плазмы описана в работе
[110]. Весь объем элюата из экстракционной колонки пропускают через
маленькую предколонку, заполненную фазой Ci8, что приводит к повышению
концентрации исследуемых соединений. Далее через эту колонку пропускают в
обратном направлении ток подвижной фазы и переводят таким образом
исследуемое соединение в аналитическую колонку. В итоге концентрация
серотонина и 5-гидроксииндолилуксусной кислоты повышается примерно в 100
раз, что позволяет проводить определение этих соединений в малых участках
головного мозга. Преимущество такого подхода демонстрируется на
