Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
ны, и единственным способом, при котором можно было надеяться связать
аналитические данные с весом ткани во влажном состоянии, был тщательный и
быстрый расчет количества воды в ткани измерением в микроанализаторе
выбранных участков спектров непрерывного излучения. Единственная надежда
на содержание полностью гидратированных образцов в течение длительных
периодов времени - это иметь срезы в тесном контакте с пленкой-подложкой
высокой проводимости.
В последних исследованиях [200] были усовершенствованы методика получения
срезов при низких температурах, методы монтажа и переноса образца и режим
анализа, так что рутинным образом можно было изготавливать срезы
множества тканей, которые остаются замороженными в гидратированном
состоянии после 3-4 ч пребывания в микроскопе. При такой процедуре
маленькие кусочки ткани помещаются на конце медных брусков и быстро
охлаждаются в жидком фреоне-12. Изготовление срезов производится в
диапазоне температур, используемых в новом устройстве для изготовления
срезов при низких температурах, установленном на микротоме, в котором
большая камера для нарезки охлаждается поступающим в камеру непрерывным
потоком газообразного сухого азота. Температура газа, а следовательно, и
температура ножа и образца могут контролироваться пропусканием азота
через изолированный резистор. Непрерывный направленный поток сухого азота
предотвращает любое образование льда в камере нарезки.
Срезы нарезаются поодиночке и переносятся на охлаждаемый жидким азотом до
температуры 123 К держатель. Держатель (рис. 12.10) и срезы, находящиеся
при температуре ~ 123 К, переносятся из камеры микротома на
предварительно охлажденный столик растрового микроскопа на стержне в
вакуумно-плотной камере на предварительно охлажденном медном массивном
держателе (рис. 12.11).
Сетка ИЗ Be
Препарирование биологических образцов для РМА
307
Рис. 12.11. Схематическое изображение герметической системы переноса с
теплоотводом в вытянутом положении [200].
Предварительно охлажденный (77 К) теплоотвод ввертывается в держатель для
переноса с пазом и оба втягиваются в камеру образца, которая затем
закрывается. Это позволяет осуществлять перенос образцов в шлюз камеры
объектов растрового электронного микроскопа.
Основным фактором для успешного изготовления толстых срезов при низкой
температуре является температура блока ткани. В работе [300] считается,
что толстые срезы, нарезанные при низких ('¦'¦'193 К) температурах,
образуются путем множественных изломов, так как срез имеет грубую
поверхность. Гладкая поверхность среза означала бы, что во время процесса
резки могли иметь место переходное плавление и таяние. С точки зрения
микроанализа важно знать, имело ли место начальное оттаивание в процессе
резки. Наличие зоны таяния в срезе и/или в блоке ткани могло бы привести
к перераспределению растворимых элементов как за время плавления льда,
так и во время быстро наступающей за этим фазы рекристаллизации.
Перемещение было бы минимальным в случае плотной клеточной матрицы с
однородным распределением, но могло бы быть весьма серьезным во
фрагментах без матрицы, которые содержат лишь воду и молекулы малых
размеров. В работах [466, 467, 200] была более подробно рассмотрена
физическая природа процесса резки на замороженной ткани и измерена
тепловая энергия, образовавшаяся при низкотемпературной нарезке. Авторы
считают, что. теплота, выделявшаяся
Рис. 12.12. Изображения замороженного в гидратированном состоянии (слева)
и высушенного лиофильной сушкой (справа) срезов ткани почечных клубочков
крысы во вторичной электронной эмиссии (а) и в прошедших электронах (б)
[200].
Отсутствие отчетливой морфологии и почти однородная плотность срезов,
замороженных в гидратированном состоянии, затрудняют абсолютную
идентификацию ткани. Идентичность фрагментов ткани подтверждается после
анализа образца, замороженного в гидратированном состоянии, что позволяет
частично высушивать образец внутри микроскопа. Маркер соответствует 300
мкм.
Рис. 12.13. Изображения срезов почечного клубочка крысы, полученных
методом лиофильной сушки, в ПРЭМ [468].
а - изображение среза вблизи кончика бугорка при малом увеличении; б -
при большой увеличении на изображении наверху справа собирательный
проток, слеза внизу виден папиллярный эпителий. Сетчатый вид тканей за
счет кристаллов льда, образовавшихся на начальном этапе лиофильной сушки.
Таблица 12.6. Фрагментные фракции воды и концентрации элементов в
замороженных срезах почечного клубочка крысы11
Фрагмент Вода. % Na р S CI К
Клетки выводящего протока мМ/кг сух. веса мМ/кг влажн. веса г/кг влажи.
веса 56,7±5,6 795+293 344+127 7,9+2,9 581+46 252+20 7,8+0,6 67+15
29+6 0,9+0,2 765+249 331 + 108 11,8+3,8 360+125 156+54 6,1+2,6
Клетки папилляриго эпителия мМ/кг сух. веса мМ/кг влажн. веса г/кг влажн.
веса 59, 5+ 10,8 708±261 287+106 6,6+2,4 597+133 242+54 7,5+1,7 93+39
39+16 1,2+0,5 785+196 318+79 11,3+2,8 348+90 141+36 5,5+1,4
