Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Безводные условия должны сохраняться в течение 3 дней инфильтрации, и за
этот период температура образцов медленно повышается до 293 К. Смола
полимеризуется при температуре 333 К-
Срезы могут быть вырезаны из блоков заполимеризованной смолы, и в
качестве кюветной жидкости не должна использоваться никакая водная среда,
так как из тонкого среза при замещении могут произойти потери элементов.
В кювете для резки использовались различные жидкости, включая ацетон, ди-
метилсульфоксид, гексиленгликоль, глицерин и силиконовые жидкости [455],
но все с ограниченным успехом. Сухие срезы толщиной около 2 мкм можно
нарезать в атмосфере сухого азота и собирать каждый срез с помощью
вольфрамовой иглы. Такие срезы могут заключаться между напыленными
угольными пленками, и они достаточно тонки для исследования и анализа в
РЭМ, работающего в просвечивающем режиме при напряжении 20-30 кВ.
Так как эти процедуры разработаны для микроанализа, то контраст от
объекта обычно очень слабый. Тем не менее возможно ориентироваться при
наблюдении клеток и тканей. При наличии небольшого опыта и с помощью
сравнительных исследований, использующих материал, препарированный
стандартным способом, может быть проведен анализ различных участков в
клетке с пространственным разрешением 0,1-0,2 мкм. Процесс изотермической
фиксации [457, 458]-разновидность высокотемпературного замораживания-
замещения - использовался для фиксации биологического материала при
относительно высоких температурах (253 К) без нарушения конфигурации льда
или гидратированного состояния кристаллической матрицы. Несмотря на то
что структурная сохранность оказывается достаточно хорошей, использование
высоких концентраций NaCl и DMSO в фиксирующей жидкости для получения
необходимого согласованного локального прогиба помешало бы использованию
этой методики в препарировании образцов для рентгеновского микроанализа.
Многообещающие аналитические результаты, полученные рядом исследователей,
не означают, однако, что заморажива-
Препарирование биологических образцов для РМА
305
ние-замещение является идеальным методом консервации. Имеется, например,
значительная вариация в растворимости (а следовательно, в экстракции)
электролитов в замещающих жидкостях. Минимальная экстракция происходит
тогда, когда используются эфиры (следующий лучший - ацетон), в то время
как при использовании спиртов имеет место значительная экстракция ткани.
В работах [459, 460] показано, что в процессе замораживания и замещения
может происходить смещение элементов. В работе [[184] дан длинный
перечень изменений в распределении элементов, которые могут происходить
при применении разных режимов замораживания-замещения в ряде различных
тканей.
Несмотря на эти недостатки, замораживание-замещение является полезным
методом препарирования, и, вероятно, его лучше всего применять для клеток
и тканей с плотной матрицей. Это могло бы ограничить количество растущих
кристаллов льда во время замораживания и замещения и свести к минимуму
расстояния возможного движения электролитов.
12.3.8. Изготовление срезов
Замороженный биологический материал можно нарезать и изучать толстые
(0,2-2 мкм) или тонкие (50-100 нм) срезы, замороженные в гидратированном
состоянии или после лиофильной сушки. Приготовление тонких срезов
адекватно описано в ряде статей [407, 450, 461, 462], в каждой из которых
старательно излагаются процедуры, которые необходимо выполнить для этой
методики. В работах [450, 463, 407] производился рентгеновский
микроанализ на тонких срезах, подвергавшихся лиофильной сушке, и был
локализован ряд растворимых элементов. В работах [461, 462, 464] недавно
был расширен диапазон температур криоультрамикротомии - нарезка тонких
срезов (50-100 нм) производилась при температурах от 148 до 123 К-Во всех
этих работах предполагалось, что нужно изготавливать срезы при более
низких температурах, чтобы быть уверенным, что не происходит случайного
оттаивания во время резки. Более толстые срезы (0,5-1 мкм) также
использовались для микроанализа, но в противоположность тонким срезам,
которые обычно анализируются после лиофильной сушки, толстые срезы обычно
препарируются и анализируются замороженными в гидратированном состоянии.
В оригинальных процедурах, разработанных в [465, 300, 426], имелась
значительная неопределенность относительно степени гидратации срезов во
время препарирования и анализа. Несмотря на то что можно изготавливать
замороженные в гидратированном состоянии срезы, после первого анализа
срезы были в значительной степени обезвоже-
306
Глава 12
Рис. 12.10. Трехмерное изображение всего узла объектодержателя,
пригодного для срезов, замороженных в гидратированном состоянии [200].
Отверстие с резьбой на бериллиевом держателе для переноса с пазом
позволяет осуществить контакт для отвода тепла в системе переноса. Пазы
на держателе позволяют осуществить хороший тепловой контакт с охлаждаемым
столиком для охлаждения в микроскопе.
