Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1.3. Возможные механизмы закрепления мутаций
После введения гетеродуплексной ДНК в клетку-хозяина (если, как это иногда бывает, одна из цепей не будет утеряна) события могут развиваться в двух направлениях.
1. Может произойти пассивная сегрегация двух цепей в ходе полуконсервативной репликации. Образуются фаговые частицы двух типов, и в случае 0-репликации выход мутантной цепи составит до 50%. Для фагов М13 вследствие асимметрич-рой репликации генома можно ожидать повышенный выход маркера.
Мутагенез в рекомбинантных нитевидных фагах
193
2. Неспаренная область гетеродуплекса перед началом репликации может подвергнуться репарации. В этом случае образуется фаговое потомство только одного типа, а выход мутанта будет зависеть от того, какую из цепей матрицы выберет ферментативный аппарат репарации неспаренных оснований. Было показано, что этот аппарат действительно оказывает большое влияние на эффективность мутагенеза [5] (см. ниже).
1.4. Репарация неспаренных оснований в Escherichia coli и необходимость метилирования аденина
в используемой для трансфекции гетеродуплексной ДНК
Имеющаяся у ?. coli система репарации неспаренных оснований вносит свой вклад в точность репликации ДНК, заменяя на пострепликативной стадии неправильно включенные нуклеотиды, не исправленные действующей в ходе репликации системой коррекции [6]. Выбор цепи для репарации основан, вероятнее всего, на временном недометилировании последовательности GATC в новосинтезированной цепи [7—9]. Другими словами, система пострепликативной репарации считает правильной информацию, содержащуюся в полностью метилированной цепи ДНК, а подлежащей замене — в неметилиро-ванной цепи.
Последовательность GATC является мишенью для метилирования аденина в положении N6 метилазой dam Е. coli [10]. Эти участки в геноме нитевидных фагов недопредставлены: у М13 их три [11] и по четыре — в геномах фагов П и fd [12]. Тем не менее было показано, что по крайней мере некоторые замены единичных нуклеотидов в сконструированных гетеро-дуплексных молекулах ДНК этих и родственных фагов подвержены зависящей от метилирования репарации как in vivo [5, 13], так и in vitro [14]. Это приводит к ряду последствий для направленного мутагенеза. Наиболее часто использующаяся сейчас методика [2] включает следующие стадии.
1. Выделение метилированной ДНК вирионов М13 из хозяина дикого типа (т. е. dam+).
2. Отжиг синтетического олигонуклеотида с геномом рекомбинантного фага.
3. Достройка цепи in vitro ДНК-полимеразой I и последующее замыкание второй цепи в кольцо ДНК-лигазой.
4. Биохимическое обогащение препарата ковалентно замкнутой ДНК-
5. Трансфекция.
Очевидно, что используемая для трансфекции гетеродуп-лексная ДНК в этом случае гемиметилирована; метилированные остатки аденина находятся только в (+)-цепи. Поэтому, если неспаренный участок ДНК подвергается репарации, ак-
13—196
194
Глава 8
тивность ее будет направлена против нужного синтетического маркера. Не приходится удивляться, что при использовании данной методики выход маркера не превышает 5%. Ниже мы опишем метод, позволяющий обойти эту трудность и, более того, обратить на пользу активность направляемой метилированием системы репарации, применяя для трансфекции гемиме-тилированную гетеродуплексную ДНК, несущую метилированные основания в (—)-цепи.
1.5. Применение частично дуплексной ДНК и использование гетеродуплексной ДНК с GATC-сайтами, гемиметилированными нужным образом
Гемиметилированную гетеродуплексную ДНК с метилированными остатками аденина в (—)-цепи получают следующим образом.
1. Фрагмент-мишень клонируют в векторе М13 и после наращивания рекомбинантного фага в йат^-хозяине выделяют неметилированную фаговую ДНК.
2. Вектор М13 (без вставки) размножают в dam+-xозяине и выделяют метилированную репликативную форму (РФ) ДНК М13.
3. РФ-ДНК расщепляют по сайту (сайтам) рестрикции, использовавшемуся для клонирования вставки.
4. Линеаризованную РФ-ДНК денатурируют нагреванием и ренатурируют в присутствии избытка рекомбинантной одноцепочечной ДНК. В результате получают гемиметилированную двухцепочечную ДНК с брешью (частично дуплексная ДНК, чдДНК), У которой метилирована неполная (—)-цепь. Экзогенная ДНК находится в одноцепочечной форме.
5. Мутантную затравку отжигают с одноцепочечным участком (брешью) и достраивают с помощью ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы (см. выше).
6. Полученные молекулы используют для трансфекции клеток Е. coli. Мутантная цепь и цепь дикого типа разделяются в процессе репликации.
7. Фаговое потомство используют для новой инфекции при низкой множественности.
Преимущества метода
1. Не происходит отжига мутантной затравки с неспецифическими участками ДНК, так как для гибридизации доступно лишь небольшое «окошко» одноцепочечной ДНК.
2. Облегчается реакция достройки, так как в чдДНК вся векторная ДНК уже находится в двухцепочечной форме.
3. Репарация неспаренных оснований ДНК не затрагивает синтетического маркера.
