Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Вместо калибровки колонки можно проанализировать аликвоты (~5%) каждой из фракций на геле вместе с радиоактивными стандартами длины. Радиоавтограф геля, на который
92
Глава 2
были последовательно нанесены фракции с колонки, представлен на рис. 6.
Подробно описанное здесь фракционирование кДНК по размеру на колонке с Био-Гелем А50т, по мнению многих исследователей, наиболее трудоемкая стадия клонирования кДНК. Тем не менее этот метод дает надежные результаты. Фракционирование кДНК можно провести также и путем электрофореза в геле легкоплавкой агарозы с последующей элюцией ДНК [19]. Этот метод более прост, однако его применение может привести к загрязнению кДНК присутствующими в огромном молярном избытке линкерами, которые способны «размазываться» по гелю и попадать во фракции большего размера. Лигирование линкера с векторной ДНК может привести к появлению в библиотеке «ложных» рекомбинантов. Риск загрязнения линкерами можно уменьшить, если перед нанесением на агарозный гель понизить содержание линкеров в препарате кДНК. Если олигомеры линкеров полностью расщеплены ЕсоЩу их можно удалить из смеси многократным осаждением этанолом, хроматографически [6] или осаждением спермином [20].
2.5.9. Расщепление ДНК %,gt10 или рестриктазой ?coRI
Для клонирования полученной двухцепочечной кДНК необходимо приготовить векторную ДНК. ДНК A,gtl0 и A,gtll выделяют методом, описанным в разд. 2.4. Так как разные партии вектора упаковываются in vitro с несколько различающейся эффективностью, новый препарат вектора перед клонированием необходимо проверить на эффективность упаковки (см. разд. 2.5.11). Если упаковка вектора in vitro происходит с удовлетворительной эффективностью, его рестрицируют ?coRI по методике, приведенной в табл. 8.
Для контроля полноты расщепления вектора упакуйте 1 мкг расщепленной ?coRI ДНК in vitro. Число образующихся при рассеве такого фага бляшек должно быть не менее чем 103 раз ниже, чем число бляшек, получающихся после упаковки такого же количества интактной ДНК. Я-вектора.
Таблица 8. Расщепление ДНК XgtlO и Я-gtll Eco RI
1. Смешайте в указанном порядке: дистиллированную воду (45 мкл минус объем ДНК и ?coRI), 5 мкл десятикратного буфера для ?coRI‘), 5 мкг ДНК Я-вектора в ТЕ 7,5; 15 единиц ?coRI. Конечный объем реакционной смеси 50 мкл.
2. Проинкубируйте 30 мин при 37 °С. Добавьте еще 15 единиц ?coRE и продолжите инкубацию еще 30 мин.
3. Добавьте 1 мкл 1 М Ка4ЭДТА и прогрейте 10 мин при 70 °С.
*) Десятикратный буфер для ?coRI содержит 0,5 М трис-НС1 pH 7,5; 1 М NaCl: 0,1 М MgCl2.
Конструирование библиотек в векторах A,gtlQ и A,gtll
9$
2.5.10. Лигирование кДНК с расщепленной ?coRI векторной ДНК
Методика лигирования фракционированной по размеру кДНК (разд. 2.5.8) с расщепленной EcoRl векторной ДНК, приведена в табл. 9.
Таблица 9. Лигирование кДНК с векторной ДНК, расщепленной Eco RI
1. Отберите фракции, приготовленные по описанной в разд. 2.5.8 методике и содержащие кДНК нужного для клонирования размера. Если во фракциях содержатся нерастворимые частицы, отцентрифугируйте их в течение
15 мин в микроцентрифуге.
2. Добавьте к надосадку, помещенному в 1,5 мл микроцентрифужную!-пробирку, 1 мкг расщепленной ?coRI векторной ДНК. Внесите ацетат натрия-до 0,2 М и два объема этанола. Проинкубируйте ДНК 30 мин на спиртовой бане с сухим льдом.
3. Осадите ДНК в микроцентрифуге 15 мин при 4°С. Промойте осадок охлажденным до —20°С 70%-ным этанолом. Отцентрифугируйте 10 мин и-осторожно удалите надосадок. Высушите осадок на воздухе.
4. Растворите осадок в 4 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgCb. Для отжига липких концов фага % проинкубируйте смесь 15 мин при 42 °С.
5. Добавьте 0,5 мкл 10 мМ. АТР; 0,5 мкл 0,1 М ДТТ; 0,1 мкл ДНК-лига~ зы фага Т4 (1,6 мг/мл). Объем реакционной смеси 5 мкл. Проинкубируйте 2—16 ч при 12—14 °С.
Параллельно с лигированием кДНК и вектора лигируйте
1 мкг расщепленного рестриктазой ?coRI вектора (без добавления вставки) и упакуйте in vitro. Оттитруйте полученный фаг на подходящем индикаторном штамме и определите, сколько-ложных рекомбинантов появляется в отсутствие вставки. Для^ AgtlO проверка заключается в подсчете доли появляющихся на хозяине BNN93 прозрачных бляшек. Методику проверки можно найти в разделе 2.5.12. В случае Xgtll для контроля подсчитывают отношение числа бесцветных бляшек к числу синих бляшек при использовании в качестве хозяина штамма Y1088 и в присутствии IPTG и XGal (методика описана в разд. 2.5.13). При оценке эффективности клонирования следует учесть число появляющихся в отсутствие вставок ложных рекомбинантов (прозрачных бляшек для AgtlO и бесцветных для A,gtll). Доля ложных (фоновых) рекомбинантов не должна увеличиваться после расщепления и лигирования векторной ДНК,. Если после расщепления и лигирования вектора фон усиливается, то возможно, что А,-ДНК, ферменты или буферы загрязнены нуклеа-зами и (или) фрагментами ДНК.
2.5.11. Упаковка гибридных молекул in vitro
