Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Так как участок, в который внедряется чужеродная ДНК* расположен внутри структурного гена р-галактозидазы, чужеродные последовательности могут экспрессироваться в виде полипептида, включенного в состав фермента р-галак-тозидазы. Скрининг библиотек геномной ДНК или кДНК, сконструированных с использованием kgtll, можно проводить при помощи антител к продуцируемым рекомбинантными клонами антигенам. Обычно проводят скрининг 105—106 индивидуальных рекомбинантов, представленных в виде бляшек на газоне штамма Е. coli, дефектного по протеазе Ion. Белок, высвобож-
Рис. 2. Карта вектора A,gtll. Сайты рестрикции приведены с указанием расстояния (в т.п.н.) от левого конца вектора. Звездочкой обозначен att-сайт. Направление транскрипции lacZ показано горизонтальной стрелкой. Внизу приведены нуклеотидная последовательность области единичного ScoRI-сайта и кодируемая последовательность аминокислот.
дающийся при лизисе клеток внутри бляшки, иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах, накладывая эти фильтры на чашки. Связанный с нитроцеллюлозным фильтром белок зондируют антителами, специфичными к искомому антигену, и связанные антитела выявляют при помощи радиоактивно меченных вторичных антител или А-белка из Staphylococcus aureus. Рекомбинантные фаговые частицы, экспрессирующие искомый антиген, выделяют из тех зон чашки, которые соответствуют полученным на фильтрах сигналам.
При разработке экспрессирующего вектора ^gtll и методики скрининга с помощью антител особое внимание уделялось проблемам, связанным с экспрессией в Е. coli чужеродных белков. Прежде всего необходимо было обеспечить определенный уровень экспрессии чужеродных последовательностей ДНК. Эту задачу удалось решить благодаря слиянию чужеродных последовательностей с последовательностями гена р-галакто-зидазы Е. coli. Вторая задача состояла в обеспечении контроля экспрессии белков, кодируемых чужеродной ДНК. Контроль необходим в тех случаях, когда чужеродный белок токсичен для клетки-хозяина и может убить ее до того, как синтезируется достаточное для иммунодетекции его количество. Эта трудность была сведена к минимуму благодаря использованию хозяина, продуцирующего в больших количествах /ас-репрессор (продукт гена lad), что предотвращает /acZ-зависимую экспрессию составного продукта в первые часы формирования бляшки. Когда число окружающих бляшку инфицированных клеток становится достаточно большим, /acZ-зависимую экспрессию запускают, инактивируя репрессор при помощи изо-пропил-р-О-тиогалактопиранозида (IPTG). При этом заметное количество чужеродного антигена образуется даже в тех случаях, когда этот антиген токсичен для клеток. Третья задача, связанная с экспрессией чужеродных белков в Е. coli, — обес-
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и Xgtll
75
печить их стабильность. Участок внутри гена р-галактозидазы, выбранный для вставки чужеродной последовательности, расположен вблизи С-концевой области р-галактозидазы, что, по-видимому, способствует стабильности составного продукта. Это особенно заметно для клеток, дефектных по /on-протеазе. Про-теаза Ion — это одна из протеаз, обусловливающих у Е. coli деградацию чужеродных или аномальных белков [8, 9]. Наличие таких протеаз часто затрудняет накопление заметных количеств интересующего нас антигена в клетках дикого типа. Поэтому для повышения стабильности составных белков в ходе скрининга был использован хозяин, мутантный по гену loti.
Система клонирования с использованием вектора ^gtll первоначально предполагала скрининг экспрессирующихся антигенов в бактериях, лизогенных по ^gtl 1-рекомбинантам [1]. Сейчас, однако, вместо этого подхода применяют скрининг фаговых бляшек [2]. Причина состоит в том, что большинство исследователей уже имеет опыт получения отпечатков фаговых бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах. Еще важнее то, что, согласно нашим наблюдениям, некоторые из рекомбинантных фагов ?t,gtll не способны формировать стабильные лизогены даже на клетках hflA (Р. Янг, неопубликованные данные). Эта проблема не решается и при использовании ^gtll-АшрЗ [10]. В связи с этим для скрининга ^gtll мы рекомендуем методику с использованием фаговых бляшек.
Так как вектор ^gtll приспособлен для экспрессии, с его помощью можно нарабатывать полипептиды (в виде составного с р-галактозидазой продукта), кодируемые уже клонированными фрагментами ДНК. Гибридный белок продуцируют клетки Е. coli, лизогенные по рекомбинантному фагу kgtll. Так как стабильность белков обычно выше у штамма, дефектного по протеолизу, и в этом случае для получения препаративных количеств белка из соответствующего рекомбинантного лизогена используют /оп~-мутанты.
1.3. Факторы, обусловливающие выбор между Xgt 10 и Я-gtH
Так как скрининг с помощью олиго- и полинуклеотидных зондов возможен для библиотек, сконструированных как в XgtlO, так и в Xgtll, перед исследователем встает проблема выбора вектора. Главное преимущество библиотек в ^gtlO состоит в том, что для этого вектора отработан эффективный метод селекции, допускающий рост только рекомбинантных фагов. Кроме того, TvgtlO обладает высокой жизнеспособностью и образует крупные рекомбинантные бляшки, однородные по размерам и форме. Эти два свойства делают вектор ^gtlO более удобным для создания библиотек, скринировать которые предполагается с помощью нуклеиновых кислот. В отличие от ?,gtl0
