Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
ной ДНК BPV-1 в отношении мышиных фибробластов NIH3T3 и С127. Вызывает, однако, удивление, что нерасщеплен-ная плазмида рМВ2 (ДНК BPV-1 в составе pML2) не трансформирует крысиные фибробласты FR3T3 [24] (табл. 3). Возможно, эти различия обусловлены разницей в генетической конституции хозяйских клеток. Эксперименты по трансформации клеток плазмидами pBVl-Dl и pdBPV69T (69Т-фрагмент в составе рАТ153 и pML2, соответственно) (табл. 2) тоже продемонстрировали различия. В то время как pBYl-Dl трансформирует клетки NIH3T3 с равной эффективностью до и после расщепления [22], pdBPV69T способна к трансформации С127 только будучи расщепленной [25] (табл. 3). Причины этого неясны; возможно, данное явление связано с различным происхождением NIH3T3 и С127 клеток. Впрочем, такое предположение маловероятно, поскольку нерасщепленная плазмида pBVl-Dl способна
32—196
498
Глава 8
Таблица 3. Эффективность трансформации клеток рекомбинантными плазмидами BPV-1
Плазмида Фермент Клетки Количество Источник
фокусов1) данных
pBPV-1 8-2 ВатШ С127 2 [25]
CI27 246
pBPV-1 9-1 HindUl С127 1 [25]
С127 197
pBPV69T Нт&Ш-ВатШ С127 1 [25]
С127 107
pBV22> HindUl NIH3T3 384 [22]
NIH3T3 667
pBPV-I-DI Hindlll-BamHl NIH3T3 300 [22]
NIH3T3 280
pdBPV'-l ВатШ С127 198 [25]
С127 200
pdBPV69T ВатШ С127 0 [25]
С127 126
pB2 ВатШ FR3T3 1 [24]
FR3T3 250
pMB2 --- FR3T3 1 [241
') Клетки трансформировали указанными ДНК с помощью кальций-фосфатиого ме
тода [27], а в работе [251 --- с последующим глицериновым шоком [28]. Эффективность
трансформации оценивали по числу фокусов иа 106 клеток иа 1 мкг рекомбинантной
ДНК [22, 24] или на 1 мкг вирусной ДНК [25].
2) pBVl и pBV2 демонстрировали одинаковую эффективность трансформации до и по
сле расщепления Hindlll (Campo, Spandidos, неопубликованные данные). В таблице при
ведены результаты для pBV2.
Таблица 4. Трансфекция рекомбинантной ДНК и селекция
морфологических трансформантов
А. Трансфекция рекомбинантной ДНК BPV (см. гл. 6 разд. 5)
1. Отщепите от рекомбинантной конструкции pBR322-BPV плазмидную часть с помощью подходящей рестриктазы, чтобы удалить «токсичную» последовательность. При работе с векторами рАТ153, pBR327, pML2 используйте интактные сверхспирализованные плазмиды.
2. За день до планируемого опыта по трансфекции высейте клетки, с которыми будет проводиться эксперимент, (104 клеток/см2) на среду, содержащую 15% FCS.
3. Растворите донорную ДНК в 0,1 мМ ЭДТА; 1 мМ трис-НС1 pH 8,0 и добавьте 2,5 М СаСЬ до концентрации 125 мМ. Концентрация ДНК должна составлять 20 мкг/мл. Если в эксперименте используется менее 1 мкг ДНК, добавьте ДНК-носитель.
4. Смешайте раствор ДНК с равным объемом буфера 2XHBS1) и пипеткой нанесите преципитат на клетки.
5. Инкубируйте клетки при 37 °С в течение 3—4 ч и затем проведите глицериновый шок (см. гл. 15, разд. 3.2)—в ряде случаев эта процедура повышает эффективность трансфекции. Можно опустить глицериновый шок — в этом случае клетки следует выдержать с преципитатом в течение 18 ч.
6. Удалите среду, промойте клетки средой без сыворотки и залейте свежей средой, содержащей 15% FCS. Инкубируйте при 37°С в течение 24 ч.
\
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования______________499
Продолжение
Б. Селекция морфологических трансформантов
1. Удалите среду культивирования и замените ее средой, содержащей только 5% FCS. Меняйте среду каждые 3 дня на протяжении приблизительно трех недель. Концентрацию сыворотки в среде поддерживайте на уровне 5%. По прошествии указанного времени становятся различимы фокусы трансформации. Если потребуется, их можно сосчитать.
