Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Гибридизационные эксперименты показали, что в геномах мух каждой из родительских линий присутствует единственный Р-транспозон
Мух из родительской линии А скрещивают с мухами СуО; гу42 и ТМЗ, rylryi2. В следующем поколении мух гу+ СуО или ТМЗ индивидуально-скрещивают снова с мухами гу42. При этом все потомство СуО оказывается гу~, тогда как потомство ТМЗ оказывается наполовину гу+ и наполовину гу~. Следовательно, ин-серция Р [гу] наследуется независимо от СуО, т. е. она расположена не во второй хромосоме. Родительскую линию В скрещивают с мухами СуО; г у*2 и ТМЗ, rylry42. В следующем поколении мух гу+ СуО и гу+ ТМЗ индивидуально скрещивают с мухами гу42. В потомстве, полученном от этих скрещиваний, фенотипы гу+ и г у- встречаются с равной частотой как среди ТМЗ-мух, так и среди СуО-мух; это свидетельствует о том,.
26*
404
Глава 5
Этап 6
Итак, получены линии мух, содержащих в геноме одиночные вставки, и проведена их первичная характеристика. Хромосому, несущую P-элемент, можно получить в гомозиготном состоянии, или же, если вставка обусловливает летальную мутацию, ее можно поддерживать с помощью балансёра. Структурную целостность Р-транспозона можно проверить с помощью блот-гибриди-зации ДНК, а локализацию транс-позона на хромосоме — путем гибридизации in situ
Этап 7
Можно приступать к запланированным экспериментам
Продолжение
что элемент не связан ни с одной из аутосом. Затем одиночных гу+-самцов скрещивают с самками гу42, несущими сцепленные Х-хромосомы. В следующем поколении обнаруживается, что все самцы — гу+, а все самки — гу~, что указывает на ассоциацию Р [гг/] -элемента с Х-хромо-сомой
Представителей родительской линии А снова скрещивают с мухами СуО; гг/42, отбирают гу+ О/О-братьев и сестер (генотип Р[гу]/СуО) и скрещивают между собой. В следующем поколении отбирают мух, не имеющих СуО, и используют их для получения гомозиготной линии PI/'/I/PI/*/]- Вставку Р[гу] родительской линии В поддерживают в пат-роклинной линии со сдвоенными X. Одиночных самцов этой линии скрещивают с самками, имеющими балансёр Х-хромосомы FM7. В следующем поколении FM7/P[ry]— самок скрещивают с самцами патроклинной линии. Потомков, не имеющих FM7 (братьев и сестер), используют для получения гомозиготной линии
трансформационного маркера и доминантного маркера балансёра позволит определить хромосому, несущую в своем составе интегрированный транспозон. Например, мы имеем родительскую линию с Р[п/]-транспозоном, интегрированным во вторую хромосому. После описанных скрещиваний появятся три группы потомков со следующими генотипами: FM7, В/+-, Р[гу\/+\
гу/гу (полосковидные глаза и гу+), +/+; CyOjP[ry\, ry/ry (загнутые крылья и гу+) и +/ + ; P[ry]/ + -, ТМЗ, Sb Ser гу/гу (короткие щетинки, зазубренные крылья и гу+). При скрещивании представителей каждой из этих групп с хозяйской гу-линией появятся как гу+-, так и гу~~-мухи с полосковидными глазами или зазубренными крыльями, однако только п/^-мухи с загнутыми крыльями и только гг/+-мухи с нормальными крыльями (табл. 1). Отсюда можно заключить, что Р [гг/]-транспозоны присутствуют во второй хромосоме. Если в геноме данной особи два Р[гг/J-элемента локализуются в разных хромосомах, их можно разделить с помощью дальнейших скрещиваний с ба-лансёрными линиями.
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
405
7.2. Блот-анализ ДНК
Параллельно с генетическими исследованиями приступают к изучению структуры интегрированных P-элементов с помощью блот-гибридизационного анализа ДНК [28]. Геномную ДНК расщепляют рестрикционной эндонуклеазой, которая имеет единственный сайт узнавания внутри рекомбинантной конструкции на основе P-элемента, содержащей интересующий ген, и полученный гидролизат фракционируют методом гель-электрофореза. Затем ДНК переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизуют с радиоактивной пробой, которая гомологична только одному из двух фрагментов ДНК, несущих концы рекомбинантной конструкции. Число гибридизующихся фрагментов соответствует количеству Р-транспозонов в популяции, а размер каждого фрагмента может служить характеристикой соответствующего сайта интеграции. Однако надо отдавать себе отчет в том, что этот подход позволяет лишь охарактеризовать в целом популяцию рекомбинантных транспозонов в данной популяции мух родительской линии. Индивидуальные же особи могут нести только один элемент из тех, что присутствуют в популяции.
С помощью подходящих рестриктаз можно также удостовериться в интактности интегрированного P-элемента, чтобы не упустить из поля зрения его возможную структурную реорганизацию. Структурные перестройки Р-транспозонов — события вполне реальные, хотя и не очень частые.
7.3. Гибридизация in situ
Гибридизация радиоактивно меченных проб, содержащих P-элементы с политенными хромосомами трансформированных линий, позволяет получить наиболее детальную информацию о сайтах интеграции этих элементов. Коротко метод заключается в следующем. Слюнные железы личинок трансформированных мух раздавливают на предметном стекле; политенные хромосомы при этом высвобождаются и расправляются. ДНК в составе хромосом частично денатурируют и гибридизуют с радиоактивно меченной или биотинированной ДНК-пробой, гомологичной интегрированному Р-транспозону. Затем с помощью радиоавтографии или иммунохимическими методами определяют расположение сайтов интеграции (полное описание экспериментальной процедуры можно найти в работах [29, 30]).
