Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4. Выделение из растений ДНК и РНК
Получение препаратов ДНК и РНК —первоочередная задача при изучении структуры и экспрессии генов на молекулярном уровне. Не являются здесь исключением и генно-инженерные эксперименты с растениями, которые основаны на технологии рекомбинантных ДНК- Начнем с того, что изолированная ДНК необходима для создания банков геномных клонов; изолированная же РНК, в частности мРНК, требуется для создания библиотек кДНК, позволяющих, во-первых, идентифицировать полезные гены, а во-вторых, иметь в распоряжении зонды для поиска в геномных банках-тех клонов, которые содержат эти гены. После того как интересующий ген удалось клонировать и его структура и организация в геноме достаточно изучены, можно ввести клонированный ген обратно в растение (если потребуется— в модифицированном виде) с помощью Ti-плазмид-ных векторов (см. разд. 2). Весьма важным моментом здесь являются идентификация и соответствующая генно-инженерная обработка промоторной области гена для обеспечения его экспрессии в трансформированном растении на достаточном уровне и на соответствующей стадии жизненного цикла. Выделение (путем клонирования кДНК) генов, активно экспрессирующихся в определенных органах и тканях растения на определенных стадиях развития, позволяет получить специфические промоторы для целей генной инженерии и, кроме того, углубляет наши знания о механизмах экспрессии генов в процессе развития организма. Процедуры выделения ДНК и РНК являются необходимым инструментом для анализа экспрессии экзогенной ДНК как в трансформированных растительных тканях, так и в целых регенерированных растениях.
4.1. Получение суммарной растительной ДНК
Описано много методик выделения ДНК из различных органов растений самых разных видов. В ряде случаев субклеточное фракционирование растительных тканей дает возможность осуществить специфическое выделение и клонирование ядерной, митохондриальной или хлоропластной ДНК. В данном разделе мы опишем обобщенную процедуру, которая широко применяется для выделения суммарной ДНК из различных растительных тканей и пригодна для работы с разными видами растений.
Генетическая инженерия растений
359
Затем мы вкратце коснемся процедур выделения ДНК из клеточных ядер, митохондрий и хлоропластов.
Главная проблема при выделении растительной ДНК заключается в эффективном разрушении клеточной стенки. К сожалению, те методы, которые используются для вскрытия клеток, вызывают фрагментирование ДНК. В связи с этим возникает необходимость искать компромисс между количеством выделенной ДНК и ее размером. Несколько облегчает задачу использование лиофильно высушенного материала (разд. 4.1.1). В то же время получение высокополимерной ДНК — это лишь полдела, поскольку растительные экстракты содержат большое количество полисахаридов, таннинов и пигментов, которые в ряде случаев очень сложно отделить от ДНК. Трудности усугубляются тем, что некоторые полисахаридные загрязнения в препаратах ДНК практически невозможно выявить с помощью обычных неразрушающих аналитических методов. Эти загрязнения мешают количественному определению нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами, а также обусловливают аномальную кинетику гибридизационных процессов. Кроме того, они ингибируют многие рестрикционные ферменты и другие ферменты, участвующие в модификации ДНК. Таким образом, блот-гибридизационный анализ и клонирование растительной ДНК часто оказываются очень затруднены.
4.1.1. Препаративное выделение растительной ДНК
Высушивание в замороженном состоянии (лиофилизация) — наиболее подходящий метод хранения растительного материала, предназначенного для выделения ДНК. Он особенно удобен, когда планируется выделять ДНК из большого числа образцов растительной ткани: можно независимо провести необходимую предварительную обработку каждого образца, промыть и лио-филизовать их, после чего использовать в работе одновременно. Высушенный растительный материал может храниться несколько лет без заметного ухудшения качества выделяемой ДНК. В таком виде его можно эффективно измельчить сухим перемалыванием или растиранием, причем ДНК в негидратированном состоянии в меньшей степени подвержена механическому фрагментированию. Нуклеолитическая деградация ДНК также минимальна, потому что ее гидратация происходит мгновенно в присутствии хелатирующих агентов и детергентов, ингибирующих нуклеазную активность.
Методика, описанная в табл. 21, основывается на свойстве нуклеиновых кислот формировать устойчивые растворимые комплексы с детергентом цетилтриэтиламмониумбромидом (СТАВ) при высокой концентрации соли (0,7М NaCl). Если понизить солевую концентрацию до 0,4М NaCl, СТАВ-нуклеино-
Таблида 21. Выделение ДНК из лиофилизированного растительного
материала
1. Смешайте 1 г лиофилизированной ткани с 4 г окиси алюминия (Sigma, type 305) и разотрите в ступке в очень тонкий порошок. Не будет преувеличением сказать, что этот этап — эффективное разрушение клеточной стенки — наиболее важен для получения ДНК.
