Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
При электрофорезе цепей гаптоглобинов в кислых гелях, содержащих мочевину, был выявлен электрофоретический полиморфизм а!-цепей [1206]. В препаратах гаптоглобина Нр 1 — 1 можно различать два типа с^-цепей, обозначаемых а11* (быстрый) и aIS (медленный) (см. рис. 107). Различия между ними обусловлены заменой одного аминокислотного остатка (лизин — глутаминовая кислота). Таким образом, фенотип Нр 1 — 1 можно разделить на три подфенотипа: две гомозиготные формы с a1F- или а13-цепями (подтипы IF*—1F и IS— 1S соответственно) и одну гетерозиготную форму, содержащую как a1F-, так и а^-цепи (подтип IF—1S). Точно так же можно различить
два подтипа гаптоглобинов с фенотипом Нр 2—1 (2—1F и
2-1S).
Недавно был описан практический метод определения подтипов гаптоглобинов [976]. С помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из плазмы выделяют белковую фракцию, обо-гащенную гаптоглобинами. Остальные белки, присутствующие в этой фракции, не мешают определению подтипа гаптоглоби-на. Белки восстанавливают дитиотреитолом (0,5 мг/мл) в 8 М мочевине. К смеси добавляют инсулин (в качестве белка-маркера с известной подвижностью) и основной фуксин и проводят электрофорез в вертикальных трубках или пластинах геля (7=10%), содержащего одну из буферных систем Девиса [281] и мочевину. Электрофорез продолжают до тех пор, пока основной фуксин не окажется на расстоянии 10 мм от нижнего края геля. Белки окрашивают амидовым черным и определяют подтипы гаптоглобинов путем сравнения полученной картины с электрофореграмм&ми белков-свидетелей.
Более редкие варианты гаптоглобинов отличаются от обычного фенотипа pH 2—1 либо в количественном (по соотношению мономерных и полимерных форм), либо в качественном (по локализации структурных изменений в а- или p-цепи) отношении (см. обзор [433]).
< Электрофорез можно также применять и для количественного определения гаптоглобинов. Содержание гаптоглобина в сыворотке определяют по ее способности связывать гемоглобин. При количественном электрофоретическом определении серию образцов анализируемой сыворотки смешивают с возрастающими количествами гемоглобина и подвергают эту смесь электрофорезу. Появление зоны свободного гемоглобина указывает из насыщение. Этот принцип был предложен Лореллом и Найма-ном [745], которые использовали электрофорез на бумаге при pH 7,0. При таком pH свободный гемоглобин мигрирует к катоду вследствие электроэндосмоса, а гемоглобин, связанный с гаптоглобином, движется к аноду. Кроме того, электрофоретические зоны свободного гемоглобина и связанного с гаптоглобином можно сканировать и определять соотношение свободного и связанного гемоглобина. Мейлин и др. [806] описали метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (pH 6,5). К 1 мл негемолизирован-ной сыворотки добавляют 50 мкл раствора гемоглобина (100 мг/мл). Пленки выдерживают 10 мин при 25 °С, затем наносят на них 20 мкл смеси и проводят электрофорез до тех пор, пока не получат достаточно хорошего разделения. Пленки фиксируют в 3%-ной сульфосалициловой кислоте и сканируют при 570 нм. Феррис и др. [378] применяли для количественного определения гаптоглобинов сходную методику, но электрофорез
III
проводили на пластинах полиакриламидного геля. Одновременно они определяли фенотип гаптоглобина. С этой целью 10 мкл сыворотки с добавленным к ней гемоглобином подвергают электрофорезу в 7%-ном полиакриламидном геле iB буфере трис-борат-ЭДТА (pH 8,3—8,4). Зоны, содержащие гемоглобин, выявляют путем окрашивания о-дианизидином с Н2Ог. Электрофореграммы сканируют на приборе, описанном этими авторами [377].
Трансферрин (система Tf).
Г енетически детерминированный полиморфизм трансфер-Р'ина (основного белка плазмы крови, переносящего железо) также проявляется в различной электрофоретической подвижности алломер-пых форм. Генетическим и структурным аспектам полиморфизма трансферрина посвящены многие исследования (см., например, обзоры [178,
433, 1252]). Полиморфизм
трансферрина был обнаружен не только у человека, но и у многих других видов позвоночных, включая приматов, домашних животных, пресмыкающихся и земноводных (рис. 108).
Как правило, фенотипы трансферрина различают с помощью электрофореза в крахмальном или полиакриламидном геле. В норме трансферрин сыворотки не насыщен железом, но для определения фенотипа его необходимо полностью насытить ионами Fe3+, поскольку свободный белок и комплекс его с железом имеют разные изоэлектрические точки [669], и, следовательно, при неполном насыщении белка будут получены ошибочные результаты. Загрязнение препаратов сыворотки бактериями может приводить к снижению подвижности трансферрина в результате ферментативного отщепления остатков сиа-ловой кислоты. Различные формы трансферрина слабо различаются по электрофоретической подвижности, поэтому определение фенотипа следует проводить путем тщательного сравне-
ГФ
с
'1
Рис. 108. Четыре генетически детерминированных варианта бычьего трансферрина (Тф) [1238]. Электрофорез в крахмальном геле после осаждения риванолом и (NH4)2S04.
