Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
1 характеризуется одной-единственной зоной, мигрирующей несколько быстрее транс-феррина. Для фенотипов Нр 2—1 и Нр 2—2 свойственна множественность полос. Фенотип Нр 2—2 представлен рядом полимеров, состоящих из полипептидных цепей, детерминируемых аллелем Нр2. Фенотип Нр 2—1 представлен другим рядом полимеров (рис. 107), каждый из которых содержит продукты генов Нр1 и Нр2, за исключением самого быстрого компонента, в котором отсутствует продукт гена Нр2 [620, 1202]. Поэтому надежное электрофоретическое изучение фенотипа гаптоглобина можно проводить лишь в крахмальном или полиакриламидных гелях благодаря присущему им эффекту молекулярного оита.
Полоновски и Джейл [1018] установили, что после связывания с гаптоглобином пероксидазная активность гемоглобина повышается. Если подвергать электрофорезу не свободный ran-
тоглобин, а его комплекс с гемоглобином, то разделенные зоны можно выявлять in situ по пероксидазной активности. При этом следует полностью насыщать гаптоглобин гемоглобином, поскольку при более низком отношении гемоглобин/гаптоглобин образуются так называемые промежуточные комплексы, отличающиеся по электрофоретической подвижности от полностью насыщенных комплексов, что может приводить к неправильному определению фенотипа. Практически для насыщения 1 мл сыворотки человека вполне достаточно 2—3 мг гемоглобина.
Смитис [1199] предложил использовать для определения фенотипа гаптоглобинов горизонтальный электрофорез в крахмальном геле. Электрофоретические методы этого типа до сих пор широко применяются при повседневных анализах. Вертикальный электрофорез [1200] дает более высокое разрешение, так как он лишен недостатков, присущих горизонтальному электрофорезу (см. гл. 1.10). Однако для определения фенотипов гаптоглобина* вполне пригоден и горизонтальный электрофорез. Смитис [1199] рекомендует использовать в качестве разделяющего буфера смесь 30 мМ борной кислоты и 12 мМ NaOH (конечный pH после смешивания с крахмалом равен
8,5), а в качестве электродного буфера смесь 0,3 М борной кислоты и 0,06 М NaOH. При определении фенотипа гаптоглобина неоднородная буферная система Паулика (76 мМ трис-5 мМ лимонная кислота как разделяющий буфер и 0,3 М борная кислота-0,05 М NaOH как электродный буфер) имеет то преимущество, что позволяет лучше отделять избыточный гемоглобин от комплекса Нр 1 — 1—гемоглобин. Многие авторы применяли для определения фенотипов гаптоглобина электрофорез в полиакриламидном геле [621, 822, 987].
Пастевка и др. [974] определяли подвижность компонентов трех основных типов гаптоглобина с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта трансферрин С. Эти авторы пытались идентифицировать фенотип Нр в анализируемых сыворотках по характеру расположения белковых зон на электрофореграмме после их окрашивания амидовым черным. Феррис и др. [378] анализировали комплексы гаптоглобин — гемоглобин методом вертикального электрофореза в пластине 7%-ного полиакриламидного геля с буферной системой трис-борат-ЭДТА (pH 8,3—8,4). Шеридан и др. [1178] для разделения комплексов гемоглобин — гаптоглобин применяли электрофорез в непрерывном вогнутом градиенте концентрации геля. Такая методика лучше, чем другие, обеспечивает разделение полимерных форм, особенно в зоне высокополимерных комплексов.
Для локализации комплексов гаптоглобин — гемоглобин in situ по пероксидазной реакции используют бензидин, гваякол,
одианизидин или лейкомалахитовый зеленый. Бензидин дает обычно нестойкую окраску, и если нужно ее сохранить, то окрашенные гели отмывают и погружают в сильно разбавленный раствор амидового черного. Зоны, содержащие гем, выявляются в виде черных полос на голубом фоне. Окраску, которую дает бензидин, можно также стабилизировать путем вымачивания геля сначала в 3%-ном растворе пирофосфата натрия в течение 3—4 мин, затем в метаноле 10 мин и, наконец, в воде. Выше мы уже упоминали о том, что церулоплазмин и комплекс гаптоглобин — гемоглобин можно выявлять в одном и том же геле с помощью двух последовательных реакций.
Энгл ер и др. [341] подвергали сыворотки электрофорезу в полиакриламидном геле в системе Орнштейна — Дэвиса [281, 942]. Затем столбики геля помещали на 18 ч в свежеприготовленный 12,5 мкМ раствор гемоглобина лошади. Избыток гемоглобина удаляли промыванием в солевом растворе, а комплексы гаптоглобин-гемоглобин окрашивали раствором бензидин-Н202.
Молекулы гаптоглобинов состоят из нескольких полипептид-ных цепей [243, 244, 1205, 1206]. Связи между отдельными по-липептидпыми цепями можно разорвать путем их восстановления в 8 А1 мочевине. Образующиеся одиночные цепи разделяют затем с помощью электрофореза в крахмальном или полиакриламидном геле в присутствии мочевины. В гаптоглобинах имеются два типа полипептидных цепей: а- и p-цепи. р-Цепи во всех гаптоглобинах одинаковы, а a-цепи различаются. а-Цепь, входящая в состав гаптоглобинов с фенотипом Нр 1 — 1 (а1-цепь), имеет мол. массу 8900, тогда как a-цепь, входящая в состав гаптоглобинов с фенотипом Нр 2—2 (а2-цепь), имеет примерно вдвое большую молекулярную массу. В гаптоглобинах Нр 2—1 содержатся как а1-, так и а2-цепи. Способность гаптоглобинов к полимеризации обусловлена наличием а2-цепей, и именно поэтому гаптоглобины Нр 2—1 и Нр 2—2 образуют при электрофорезе целый ряд зон, соответствующих гомологичным полимерам, а монодисперсиый гаптоглобин Нр 1 — 1, мигрирует в ви-виде одной-единственной зоны.
