Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
для культивирования. Критическая плотность клеток обеспечивает оптимальную концентрацию диффундирующего фактора роста, которая зависит от расстояния между жизнеспособными клетками, способными к росту [17]. Для повышения эффективности посева проб, в которых
Рис. 9.1. Эпителиоидные клетки на 20-е сутки культивирования.
Однослойная культура, полученная из пробы амниотической жидкости, взятой на 15-й нед беременности (фазовый контраст, 500Х).
содержится небольшое число клеток, Стил и Брег [10] применили метод слоя-кормилки: они высевали клетки амниотической жидкости на слой облученных фибробластов.
Фог. и Лунд [18] первыми получили передаиваемую линию эпителиальных клеток из амниона человека. Для роста клеток была использована среда, содержащая раствор Эрла, 20% бычьей сыворотки и гидролизат лак-тальбумина.
Хотя, по-видимому, нет определенных данных о том, что клетки амниона сохраняют способность к росту по-
еле отслаивания в амниотическую жидкость, морфология плоских эпителиоидных клеток линии FL сходна с морфологией клеток амниотической жидкости, культивируемых в среде 199 с 30% бычьей эмбриональной •сыворотки (рис. 9.1). Наиболее вероятно, что клеточным культурам из амниотической жидкости дают начало разные типы клеток, а именно клетки амниона и недифференцированные клетки энтодермального происхождения; при этом образуются колонии, состоящие из фибробластоподобных и эпителиоидных клеток. Через несколько пассажей в быстрорастущих культурах преобладают фибробластоподобные клетки, хотя в большинстве случаев первичные культуры имеют эпителио-идный тип роста.
Из многих методов /культивирования клеток амниотической жидкости мы включили в эту главу методы Сантессона [13] и Надлера и Джерби [16], поскольку указанные методы позволяют в кратчайший срок получить препараты для анализа хромосом, причем случаи успешных культур составляют почти 100%. Кроме того, здесь описан простой метод, которым мы пользуемся в лаборатории (Department of Pathology, Southmead Hospital, Bristol). Применение этого метода, хотя и не столь быстрого, обеспечивает успешное культивирование клеток большинства проб как для цитогенетического, так и для биохимического исследований. Все методы культивирования предусматривают инкубирование клеток при температуре 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02.
МЕТОД А [13]
*
Объем пробы. Для анализа берут 10 мл пробы.
Сосуды для культивирования. Флаконы Карреля диаметром 50 мм и пластиковые чашки Петри диаметром также 50 мм.
Культуральная среда. Равные части сбалансированного солевого раствора Хэнкса и среды 199, 20% смешанной человеческой сыворотки, 5% бычьего эмбрионального экстракта (Difco), антибиотики,
Метод
Пробы жидкости по 3 мл центрифугируют, осадок клеток промывают средой. Суспензию клеток из каждой пробы сеют в отдельный сосуд для культивирования. Рост становится заметным через несколько дней; спустя
4—12 сут клеток становится достаточно для исследования хромосом и пересева.
МЕТОД Б [161
Объем пробы. 10 мл пробы собирают либо в пластиковые, либо в силиконированные стеклянные пробирки.
Сосуды для культивирования. Небольшие чашки Петри фирмы Falcon.
Среда для культивирования. Среда F-10 с 15% эмбриональной бычьей сыворотки, в которую добавлена смесь антибиотиков против бактериальной и грибковой инфекций.
Метод
После центрифугирования осадок клеток суспендируют в 0,5 мл эмбриональной бычьей сыворотки и разливают в 5 чашек Петри. Клетки иммобилизуют, положив на них покровное стекло, затем добавляют 2—3 мл среды. Среду меняют через день, пока под покровными стеклами не вырастут колонии {обычно это бывает на 7—18-й день), после чего покровные стекла вынимают, перевертывают и помещают в новые чашки Петри для получения новых культур. В обе культуры добавляют свежую среду. Через 24 ч после соответствующей обработки растущих на этом покровном стекле клеток получают препарат хромосом; субкультуру после некоторого числа пересевов используют для биохимического исследования.
МЕТОД В [14] (МОДИФИЦИРОВАННЫЙ)
Объем пробы. Для анализа берут 10 мл пробы.
Сосуды для культивирования. Флаконы Карреля диаметром 50 мм, стандартные стеклянные пробирки Лейтона с площадью для культивирования 40ХЮ мм.
Среда для культивирования. Среда 199 (Wellcome Re* agents Ltd., Beckenham, Kent) с 30% эмбриональной бычьей сыворотки (Flow Laboratories, Ltd., Irvine, Ayr* shire).
Метод
1. Пробы центрифугируют при 1000 об/мин в течение
5—10 мин.
2. Если в осадке клеток содержится примесь крови, то его ресуспендируют в 1 мл среды 199 и добавляют 8 мл 0,83%-ного раствора хлористого аммония (охлажденного до 4°С), который частично лизирует эритроциты [19]. Эту смесь оставляют на 3 мин при 4°С, а затем добавляют 1 мл эмбриональной бычьей сыворотки, чтобы остановить лизис клеток. Повторным центрифугированием получают осадок клеток.
