Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
торые исследователи [49, 70] добавляют в среду источники липидов, причем показано [49], что метиловые эфиры ненасыщенных жирных кислот с длинной цепью стимулируют рост, тогда как насыщенные жирные кислоты с длинной цепью и жирные кислоты с разветвленной цепью такой способностью не обладают. В течение нескольких лет Микл [71] изучал свойства фракции сыворотки, влияющей на распластывание клеток. Он обнаружил, что ее можно заменить карбамилфосфатом, который при добавлении к синтетической среде хорошо замещает цельную сыворотку, особенно в присутствии инсулина. Среда F-10 (табл. 1.3), предложенная Хэмом
[73], предназначена для выращивания клеток при добавлении очищенных белков. Оптимальная концентрация всех компонентов этой среды установлена экспериментально. Среда F-10 используется либо с сывороточным альбумином или фетуином, либо с низкими концентрациями сыворотки.
В течение ряда лет многие цитобиологи стремились создать для 'культивирования клеток среду химически определенного состава, в которую не нужно было бы добавлять белки. Еще в 1911 г. Льюис М. и Льюис У.
[74] пытались решить эту проблему, обнаружив, что глюкоза, аминокислоты и пептиды, добавленные в солевые растворы, увеличивают время выживания тканей куриного зародыша. Современные попытки решить эту проблему относятся к созданию в 1950 г. среды 199
[75] (табл. 1.4). Среда 199 содержит почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеиновых кислот, дополнительные факторы роста, источники липидов и раствор Эрла, в который входит также азотнокислое железо. Эта чрезвычайно сложная среда по-прежнему широко используется как поддерживающая среда, а при добавлении сыворотки — как ростовая среда. При полном отсутствии сыворотки, однако, жизнеспособность клеток на ней охраняется относительно недолго.
Позднее среду 199 модифицировали [76], и она получила название среда 858. Эта среда была значительно эффективнее среды 199. Благодаря увеличенному содержанию восстановителей (гидрохлористого L-цистеина,
Таблица 1.3 Состав среды Хэма F-10 (мг/л)
(в скобках приведены эквиваленты для аминокислот, выраженные в мМ)
Аминокислоты
L-алааин 8,91 (0,1)
L-аргинин, гидрохлорид 211,00 (1,0)
L-аспарагиновая кислота 13,30 (0,1)
L-аспарагин, гидрохлорид 15,00 (0,1)
L-цистеин, гидрохлорид 31,50 (0,2)
L-глутаминовая кислота 14,70 (0,1)
L-глутамии 146,20 (0,1)
Глицин 7,51 (0,1)
L-гистидин, гидрохлорид 21,00 (0,1)
L-изолейции 2,60 (0,02)
L-лейцин 13,10 (0,1)
L-лизин, гидрохлорид 29,30 (0,1)
L-метионин 4,48 (0,03)
L-фенилаланян 4,96 (0,03)
L-пролин 11,50 (0,1)
L-серин 10,50 (0,1)
L-треонии 3,57 (0,03)
L-триптофан 0,60 (0,003)
L-тирозин 1,81 (0,01)
L-валин 3,50 (0,03)
Витамины
Биотин 0,02
Пантотенат кальция 0,71
Холинхлорид 0,69
Фолиевая кислота 1,32
Инозитол 0,54
Никотинамид 0,61
Пиридоксин, гидрохлорид 0,20
Рибофлавин 0,37
Тиамин, гидрохлорид 1,01
Витамин В12 1,36
Предшественники нуклеиновых
кислот
Гипоксантин 4,08
Тимидин 0,73
Источники липидов
Липоевая иислота 0,20
Источники углеводов
(кроме глюкозы)
Пмруват натрия 110,0
Соли
FeS04-7H20 1,52
CuS0v5H,0 0,004
ZnS04-7H2Q
NaCl
КС1
NasHPO*
KH2P04
MgS04-7H20
СаС12
NaHC03
0,05
7400.00 285,00 153,60 83,00 152,80 33,30
1200.00
Глюкоза
1100,00
аскорбиновой кислоты и глутатиона) слишком высокий окислительный потенциал, характерный для среды 199, в среде 858 приближается к физиологическому уровню. Пять витаминов группы В: тиамин, рибофлавин, ниа-цин, ниацинамид и пантотеиат — исключены из ее состава, поскольку они являются составными частями шести добавляемых коферментов. Через два года среду 858 видоизменили в среду CMRL-1066 [77]. Четыре жирорастворимых витамина: A, D, К, Е — были заменены пятью упомянутыми выше витаминами группы В. Эта среда — результат семилетних поисков, сотен составленных экспериментальных сред; она способна обеспечить рост постоянных клеточных линий в отсутствие сыворотки. Позднее Вэймаут [78] предложила среду с более простым составом. Ее среда 752/1 (табл. 1.5) сейчас широко используется.
