Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
А. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Многие вирусологические тесты можно проводить в микрочашках, причем клеточную суспензию (ее получают из монослоя) добавляют либо сразу же после разбавления вируса, либо после предварительной инкуба* ции смеси сыворотка — вирус. Этим система отличается от других, в которых исследуемый материал добавляет-
ся к клеткам сформированного монослоя. Часто методика с использованием клеток сформированного моно-слоя оказывается невыгодной, поскольку требует больше времени, смены питательной среды и отмывки перед проведением теста. Кроме того, не используется основное преимущество микросистемы, так как при вращении петли повреждается клеточный пласт; в связи с этим разведения приходится делать в пустой пластинке, а затем уже переносить в пластинку с культурами. Тем не менее, если все же необходимо работать с монослоем клеток, то микрометоды значительно экономичнее макрометода, проводимого в пробирках.
В табл. 3.2. представлена схема опыта по титрованию инфекционности вируса и определению сывороточных антител в реакции нейтрализации. В таблице указан объем разбавителя для двукратных разведений; можно применять и большие объемы при условии, что после разведения количество питательных веществ для роста клеток будет достаточным.
Титрование вируса или сыворотки и типичная реакция нейтрализации схематически показаны на рис. 3.11. С помощью микропипетки в серию лунок на пластинке добавляется по одной капле растворителя (0,025 мл). Число таких лунок зависит от предполагаемого титра исследуемого материала. С помощью петли исследуемый материал (вирус или сыворотка) вводится в первую лунку. Перемешивание материала осуществляется вращением петли пять или более раз. Разбавленный материал (0,025 мл) петлей переносится из первой лунки во вторую и т. д.
Для проведения реакции нейтрализации к каждому разведению сыворотки прибавляют микропипеткой одну каплю определенной дозы вируса и, осторожно постукивая пластинки кончиком пальца, перемешивают. Смесь сыворотки с вирусом инкубируют в течение соответствующего периода времени и затем в каждую лунку добавляют одну каплю суспензии клеток и постукиванием пластинки диспергируют клетки. Каждый тест должен включать соответствующие контроли, такие, как клеточный контроль, контроль дозы вируса и токсичности сыворотки. В лунки капают масло или заклеивают
Схема опыта титрования вируса или реакции неАтралиэации в микросистеме
Определение ннфекциоикости вируса
г
о,
8
I
ШI ilsl
ч aw? ° л 5
ей я
Is
g ? О.
II
т
В
Я
а.
га
(S
3 *х а. о w *
да
СО_____________________
§3
ы a v 2 -| §¦
|eg в
га
Й
о
СЬ
h
X
И
2. <и
* X
я *
2 ш«х
я у 9 1>
р. 4» О О.
О
ffl в о * о®а
sSi8
ч“=?
s
tbb Си Я §
5s§
з 5
О*
&ВЙ
111 S ? “¦
О
LO
cs
о
O
Cl. (Q
Ж О s a.
,8
«в
ь
d>
%
2
я
с
2 § ч rt R * ?h~ _ *t I ®
'роч
SO *> |o =
M!
V M
A Л X
• Iм s
*-ag
* ? E
S я 5
X 4 rt CSG
fi 9. *•
и И С
. el|
•о а
? Й S
1Е “ g&°-'813
Л Ё И
= &s
3 п .'Р и ^ОР*
8.
сз
н
?
6 о
О. 44
¦ 2 « о>
№ о
и I К I
Я V
О* я
5« 3 |
о> V • О.*
•и в С CJ
СЬ
* ^ >% ^
Й а»
>.К
с.«
х >* а к
?- s О * й t
3 0
с.
S 5>
ш I
sg « ^ к
et 3
>% I
а.!
* ;
ш |
к
X
*й
6^
S1
0 Ш
яй
в S
4) О
SS
5S
t- . Я О « ®и|оо
?s?§4-
их пластырем и инкубируют либо в течение определенного периода времени, либо ориентируются по контролю дозы вируса.
Обычно реакцию нейтрализации осуществляют титрованием сыворотки определенной дозой вируса; реже пользуются другим методом — титрованием последовательных разведений вируса постоянным объемом сыворотки. Любой из этих методов пригоден для проведения реакции нейтрализации в микросистеме.
Если это необходимо, то на одной пластинке можно одновременно поставить 2 опыта: с разведением сыворотки и с разведением вируса {шахматное титрование). Такой метод удобен для определения оптимальных соотношений антигена и антисыворотки.
Пластинки также удобны для определения количества вируса, оставшегося после реакции нейтрализации (рис. 3.12). В этом случае смесь вируса и антисыворотки инкубируют с клетками, причем опыт ставят лишь на части пластинки. Через определенный промежуток времени просматривают инкубируемые клетки для определения степени цитопатического эффекта (ненейтрали-зованный вирус). В неиспользованные на пластинке лунки добавляют разбавитель и ранее инфицированные культуры. Петлей готовят разведения, а затем в лунки добавляют клетки свежих культур. Пластинку снова инкубируют, после чего определяют количество живого вируса, оставшегося после нейтрализации. Такой метод является более чувствительным и более количественным, чем общепринятая реакция нейтрализации. Особен* но рекомендуется применять его при анализе интерферона, когда количество активного материала очень мало.
