Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
а)
tr
3 g
CL
i-
5 S
si
* Si
4
2 s
я C"^
5 6 & |54
2s— s
ей
4 a
*?}3
Я
га *
ю те „—.
5 j д
(О rtl tJ =1 ~
dJ %—' S
c
среды для культивирования клетак.
ки имеют тенденцию к агрегации, их нужно разъединить, осторожно постукивая по пластинке. За диспергированием клеток следят с помощью микроскопа. Отверстия лунок закрывают либо двумя каплями масла, либо заклеивают прозрачным пластырем. Это делается для того, чтобы избежать чрезмерного испарения воды и потери СОг в атмосферу при инкубации в обычном бактериологическом термостате. Если имеется термостат с подачей СОг, то пластинки просто закрывают от пыли колпаком. Повышенное содержание С02 в атмосфере (5%) особенно желательно при культивировании диплоидных клеток. В термостате любого типа необходима высокая относительная влажность.
Для создания атмосфер различного состава (различные комбинации и концентрации газов) можно использовать специальный герметический сосуд (Scientific Supply Co., Chicago, 111.), показанный на рис. 3.9. Первоначально с его помощью создавали анаэробные условия для бактериальных культур, но оказалось, что он удобен и при культивировании клеток в микрочашках. Система двух клапанов в крышке дает возможность заменять газы в сосуде (из баллонов) после того, как пластинки помещены в сосуд. Когда в сосуде создастся соответствующая атмосфера, его помещают в обычный термостат. Таким образом, можно легко воспроизводить разные условия для культивирования. Эта система позволила искусственно воссоздать атмосферу Марса и исследовать ее действие на рост клеток
[29L
Продолжительность инкубации зависит от типа клеток. Обычно через 2—3 дня все клетки, кроме клеток
Ряс. 3,9. Герметический со-суд для культивирования клеток в микрочашках в заданной атмосфере (уменьшено в 9 раз).
90
М. Розенбаум, Э. Сулливан и Э. Эдвардс
первичных эксплантатов, формируют монослой. Клетки первичной культуры почки обезьяны образуют монослой через 7 дней, но этот срок можно уменьшить, взяв в работу клетки второй генерации. При условии периодической смены среды культуры клеток в микрочашках, как правило, можно сохранять в течение 7—14 дней.
В. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ КУЛЬТУР
На рис. ЗЛО показано, как выглядят различные типы клеток после образования ими монослоя. Эти фотографии живых клеток сделаны с помощью инвертированного микроскопа при малых увеличениях, так что в одном поле зрения видны все клетки, образующие монослой. Таким образом можно быстро оценить общее состояние каждой культуры. По своей морфологии клетки не отличаются от тех, которые растут в пробирках. Наличие гроздьев клеток свидетельствует о том, что клетки были плохо диспергированы. Появление гроздьев из округлых и пикнотических клеток может быть также результатом токсичности либо самой пластинки, либо какого-нибудь компонента системы.
ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В МИКРОЧАШКАХ
Наиболее широко такие культуры используются в вирусологических исследованиях для идентификации вирусов и для определения в сыворотке вирусных антител. Многие из этих методов применяются в эпидемиологических исследованиях вируса полиомиелита [7, 8, 19, 20], реови зусов [15], вируса коксеки [21], ринови-русов [22, 23], вирусов парагриппа и гриппа [24—26], краснухи [27, 28], осповакцины [24] и аденовирусов [30, 31]. Некоторые исследователи сравнивали результаты, полученные с помощью микро- и макросистем. Во всех случаях результаты вполне согласуются друг с другом, и все авторы указывают на огромные преимущества микросистем при массовых серологических исследованиях.
Культивирование клеток в пластиковых панелях
91
Рис. 3.10. Морфология неокрашенных монослоев, образованных различными клетками: при культивировании их в микрочашках
(17Х) [91.
А. Эпителиоидные клетки человека (HeLa). Б. Диплоидные клетки легких человека (WI-38). В. Эпителиоидные клетки человека (КВ). Г. Эпителиоидные клетки человека (НЕр-2). Д. Клетки вторичных культур почки обезьяны.
Е. Клетки почки кролика (RK-13).
