Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
5-1. Один миллимоль содержит 6* 1020 метильных групп. Если каждая из них содержит один атом 3Н, полознна из них, или 3 * 1020, будут распадаться за 12 лет. Таким образом, радиоактивность равна 2,5 -1019 расп/год, или 8 * 1011 расп/с, или 22 Ки. Следовательно, 6/22 = 27% молекул тимнднна включают радиоактивную метку.
Молекула ДНК с молекулярной массой 25*10° содержит 75 700 основании или 18 940 остатков тимндина, из которых 18 940-0,27 = 5100 являются радиоактивными.
Если с помощью счетчика с эффективностью 52% для образца получено значение радиоактивности 1000 имп/мин, его действительная радиоактивность соответствует 1000/0,52= 1923 имп/мин = 8,7* Ю-10 Ки. Отсюда содержание ти-мидина (1/6)-8,7-10-10= 1,45-10-10 ммолей тимидина, или 1,45*10“13 молей. Если 50% пар оснований ДНК составляет А*Т, то на каждый моль тимидина приходится 3 моля других нуклеотидов. Средняя масса одного моля нуклеотида равна 330 г. Следовательно, масса ДНК, соответствующая 1000 имп/мин, равна 330-5,8-10~13 = 1,9* 10-10 г.
5-2. 3Н и 32Р являются наилучшей парой, поскольку уровни сцинтилляци-онного счетчика можно установить таким образом, что в канале 3Н будет находиться только малая часть радиоактивности 32Р.
5-3. Лучше всего для этого подойдет 3Н-тимидип, поскольку он включается только в ДНК, тогда как 32Р включается также в РНК, фосфопротеины и фосфолипиды.
5-4. В канале 14С радиоактивность 3Н отсутствует, а в канал 3Н попадает 20% радиоактивности 14С. Следовательно, 1620 имп/мин в канале Б соответствует только 14С. Однако 0,2-1620 = 324 имп/мин 14С в канале А. Следовательно, общая радиоактивность 14С составляет 1620+324=1944 имп/мин, а радиоактивность 3Н равна 1450—324 = 1126 имп/мин. Соотношение 3Н/14С составляет 1126/1944 = 0,58.
5-5. С поправкой на эффективность счета радиоактивность 3П равна 4504 расп/мин, а радиоактивность иС составляет 2371 расп/мип. Соотношение 3Н/14С равно 4504/2371 = 1,90. Отсюда молярное отношение тимидина к ури-дину 1,90/(6/0,5) =0,16.
Радиоактивность тимидина равна 4504/(2,2* 1012) =2,1 ¦ 10~9 Ки, что эквивалентно (1,6)-2,1 • 10-9 —3,5-10~13 молей. В ДНК, содержащей 43% G-C, 0,285 всех нуклеотидов составляет тимидин. Следовательно, имеется (1/0,285) -3,5-10“13 молей, или 4* К)'10 г ДНК.
Радиоактивность уридина равна 2371/(2,2-1012) = 1,08-10~9 Ки, или 2,16* 10~12 молей. Количество молей нуклеотидов РНК составляет (1/0,28) X Х2,16-10—12 — 7,7¦ 10“12 или 2,54* 10"9 г РНК-
ГЛАВА
5-6. ДНК с молекулярной массой 20 * 10G содержит 6* 104 атомов; отсюда соотношение э2Р/зф составляет 1/(6*104), а концентрация 32Р в среде должна быть 10“3/(6* 104) = 1,6-10“8 моль/л, или 1,6*10“п моль/мл.
5-7. Возможная ошибка приблизительно 1% означает, что N1/'2 должно быть равным 0,01, где N—общее количество отсчетов. Отсюда образец необходимо считать по меньшей мере (1/752) • 104= 13,3 мин.
5-8. Скорость счета не будет зависеть от объема, так как образец считается двумя фотоумножителями. Фон, обусловленный радиоактивностью окружающей среды, будет уменьшаться с уменьшением объема.
5-9. Отношение каналов (Б/А) для каждого стандарта для тушения необходимо подсчитать, после чего получить зависимость его от эффективности определения; например, (А+Б)/1000. Из этой зависимости следует следующее уравнение: эффективность определения —отношение каналов. Поскольку для образца наблюдается соотношение каналов 1211/1822 — 0,66, действительное значение радиоактивности равно (1211 +1822) /0,66 = 4595 имп/мин.
5-10. Образец объемом 0,1 мл содержит 0,04-25=1 мкг лейцина. Радиоактивность его равна 1251/0,70= 1787 имп/мин = 8,1 ¦ 10~4 мкКи. Удельная радиоактивность составляет 8,1 10-4 мкКи/мкг. В первоначальной культуре концентрация радиоактивности составляет (0,1 *50*25)/10 = 12,5 мкКи/мл концентрация прибавленного лейцина равна (0,1 - 25) /10 = 0,25 мкг/мл. Поскольку удельная радиоактивность белка значительно меньше удельной радиоактивности добавленного 14С-лейцина, в среде должен находиться 12С-лейцин с концентрацией 1,54-104 мкг/мл. Это значение настолько велико, что увеличением концентрации за счет прибавляемого лейцина можно пренебречь. Поэтому для того, чтобы увеличить скорость счета с 1251 до 5000 имп/мин, т. е. в 4 раза, достаточно просто прибавить в 4 раза больше 14С-лейцпна, или 0,4 мл.
5-11. Отношение скорости счета к шуму равно 3,7 для счетчика Гейгера — Мюллера и 1,9 для сцинтилляционного счетчика. Поскольку ожидается малая скорость счета, достоверность будет большей в том случае, когда фон вносит меньший вклад. Поэтому предпочтение следует отдать счетчику Гейгера — Мюллера. Естественно, что для получения той же ошибки образец при этом должен считаться большее время, чем с использованием сцинтилляционного счетчика.
6-1. Фаги выращивают в среде, содержащей 3Н-тимидин. Затем их облучают различными дозами рентгеновских лучей (включая нулевую). Далее фаги адсорбируются бактериями и вводят в них ДНК. Фаги удаляют из бактерий с помощью энергичного перемешивания. Бактерии отделяют от фагов, помещают на стеклянную пластинку, высушивают и покрывают либо покрывающей пленкой, либо тонким слоем эмульсии методом погружения. После экспонирования и проявления считают число зерен (п) над клетками и число клеток с зернами (N). Значение п, полученное для нулевой дозы облучения, соответствует числу зерен всей молекулы ДНК. Если облученный фаг вводит всю свою ДНК, то п и N не будут зависеть от дозы. Если же вводится только фрагмент, то п будет уменьшаться, а N будет оставаться примерно одинаковым.
