Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Метод равновесия был первоначально разработан в связи с тем, что математические уравнения, описывающие транспорт молекул в поле центробежной силы, могли быть разрешены для условий равновесия, когда в любой точке ячейки центрифуги от-
сутствует какой-либо поток. Метод Арчибальда использует тот факт, что в любое время (не только при равновесии) либо у мениска, либо у дна ячейки отсутствует перемещение вещества. Хотя ясно, что перед достижением равновесия изучаемые макромолекулы совершают некоторое движение от мениска и накапливаются у дна, это утверждение просто означает, что вещество не выходит за пределы ячейки и не попадает в нее извне. Математическим следствием из этого является возможность определения М с помощью измерения обеднения макромолекулами мениска и накопления их у дна ячейки в любой момент времени* Для этого используют следующие уравнения:
(dcjdr)а _ Ма (1 — и р ) (с0 — са) ^ (l — у р )
ra RT RT
(дс/dr)a __________Мп (l Ар) (с0 cu) | MQ (l у р ) с0 ^ (15)
<*>2лв RT RT
где с — концентрация макромолекул на расстоянии г, с0— начальная концентрация, г — расстояние от оси вращения, при котором измерено зничение с, а индексы «а» и «в» соответствуют мениску и дну соответственно.
Преимуществом метода Арчибальда является короткий период седиментации, а главным недостатком — необходимость проведения измерений очень близко к мениску и дну ячейки, что снижает их точность.
Седиментационное равновесие в градиенте плотности
До сих пор мы рассматривали случаи, когда плотность изучаемых молекул намного превышала плотность растворителя. В этом разделе будет описан важный метод седиментационно-го равновесия в градиенте плотности (его разработали Мэтью Мезелсон, Франклин Шталь и Джером Виноград), в котором плотность растворителя почти такая же, как и плотность изучаемой молекулы. Этот метод требует присутствия третьего компонента (обычно соли цезия) с низкой молекулярной массой и высокой плотностью. При центрифугировании раствора соль перераспределяется [в соответствии с уравнением (13)] с достижением равновесия, образуя тем самым градиент концентрации, который имеет меньшую плотность сверху и большую — у дна пробирки, т. е. градиент плотности. Макромолекулы при этом
J
РИС. 11-39.
Движение молекул ДНК к положению равновесия при центрифугировании в градиенте плотности CsCl. Высота кривой соответствует концентрации ДНК в каждой точке ячейки. Площадь под кривой остается постоянной.
РИС 11-40.
Параметры зоны в градиенте CsCl.
------концентрация ДНК;------------
плотность раствора; г0 — расстояние от центра зоны до оси вращения; Go — плотность в центре зоны; о — ширина зоны при 1/е высоты.
также седиментируют, однако вещество от верха ячейки движется через градиент центробежно, а от дна — центростремительно (рис. 11-39). Этот процесс продолжается до тех пор, пока макромолекулы не образуют зону в том месте градиента, где плотность макромолекул равна плотности раствора (рис. 11-40). (В этом случае плотность макромолекул соответствует плотности раствора соли цезия в воде.) Ширина зоны определяется соотношением между центробежной силой (которая способствует сужению зоны), диффузией (уширяющей зону) и градиентом плотности (чем круче градиент, тем уже получается зона).
В настоящее время этот метод используется почти исключительно для ДНК и бактериофагов; в ряде случаев его применяют для РНК и рибосом, однако для белков он используется редко. Приведенное здесь обсуждение относится к ДНК и фагам.
Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия в градиенте плотности
Теория седиментационного равновесия в градиенте плотности усложняется тем, что: 1) для создания градиента обычно применяют очень высокую концентрацию соли (5—7 М), что не позволяет рассматривать систему как двухкомпонентную, 2) положительно и отрицательно заряженные ионы соли распределяются в объеме неодинаково, так как они обладают разными молекулярными массами и коэффициентами диффузии, а это приводит к созданию градиента электрического потенциала, и 3) скорости центрифугирования настолько высоки, что уже нельзя пренебрегать влиянием давления. По этой причине данный метод обычно не используется для определения молекулярных масс, однако, так как его можно применять, если данные обрабатываются соответствующим образом, приведем краткое его описание.
Если игнорировать факт наличия трехкомпонентной системы, можно вывести следующее уравнение:
м =-------------- , (16)
a2 (ipjdr) ш2/*
где р0 — плотность в центре зоны, а — ширина зоны при Не высоты, dpldr—градиент плотности, со — угловая скорость (рад/с) г0 — расстояние от центра зоны до центра вращения. Неоднократно было замечено, что это уравнение дает заниженные значения М (обычно примерно в 2 раза), причем ошибка возрастает с увеличением М. Считалось, что это является следствием пунктов 1 и 2, приведенных выше. Однако Карл Шмид и Джон Херст показали, что причиной этого служат неточности при измерении dp/dr и концентрационные эффекты макромолекул в зоне. Проблема измерения dp/dr была решена путем определения разделения двух полос, которые различаются по плотности, путем изотопного замещения (например, 14N на 15N или 12С на 13С) в случае данной молекулы, плотность которой известна. После этого можно использовать уравнение (16) для получения точного значения М с помощью экстраполяции до нулевой концентрации с использованием уравнения
