Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Как отмечалось выше, при нанесении образца на более плотный раствор без предварительно созданного градиента граница будет разрушаться под действием конвективных токов. Виноград заметил, что если приготовить образец в растворе очень низкой плотности, то вследствие диффузии растворенного вещества, используемого для увеличения плотности более плотного раствора со временем, перепад плотности, генерируемый на поверхности раздела, будет медленно распространяться вдоль центрифужной пробирки, образуя пологий градиент. Под границей, образуемой распространяющимся градиентом, градиент отсутствует и имеет место конвекция. Однако в распространяющемся градиенте и над ним происходит стабилизация, предотвращающая конвекцию. Ясно, что в течение седиментации материала градиент будет двигаться перед ним, поэтому материал постоянно будет находиться в градиенте плотности, что дает возможность нормального хода седиментации. Кроме того, если растворенное вещество в более плотном растворе обладает особо высокой плотностью (для этого чаще всего используют CsCl), то соль будет также в незначительной степени седиментировать с образованием дополнительного стабилизирующего градиента. Этот метод известен под названием зональной седиментации в самогенерирующемся градиенте плотности.
На рис. 11-28 изображена конструкция ячейки центрифуги, которая используется в этом методе. В ячейку предварительно помещают раствор с высокой плотностью (обычно 2 М CsCl), после чего отверстие для ввода образца заполняют раствором изучаемого вещества. Вскоре после разгона центрифуги материал протекает через царапину на поверхности ячейки и наносится тонким слоем поверх более плотного раствора. При увеличении скорости вращения происходит седиментация. Пока скорость не
2
РИС. 11-28.
Вид сверху на сердечник, служащий для образования зон.
Растворитель (заштрихованная площадь) вводится в сектор через отверстие для запол-нения. Образец помещается в круглую полость. При ускорении образец течет по царапине и образует слой на поверхности растворителя. На рисунке изображен процесс по-
лучения слоя образца. Заметим, что раствор образца течет только по царапине, так как сердечник всей своей поверхностью плотно соприкасается с окном. (Конструкция разработана Джеромом Виноградом, Калифорнийский технологический институт.) 2 — отверстие для заполнения; 1 — царапина.
РИС. 11-29.
^ Седиментация двухцепочечной ДНК фага Т7 в ячейке, образующей зону (рис. 11-28). Время центрифугирования увеличивается от А
к Б, буквой М обозначен мениск
Б
М
Направление седиментации
слишком высока, зона не нарушается. Рис. 11-29 показывает обычные типы распределения концентрации (полученные при измерении ультрафиолетового поглощения) ДНК при седиментации через концентрированный раствор CsCl. Обратите внимание, что из-за более быстрого движения материала в направлении движения граница становится асимметричной. Это легко объясняет-
ся концентрационной зависимостью; вещество на передней стороне границы находится в меньшей концентрации и поэтому движется быстрее. Тыльная сторона границы выглядит более четкой, поскольку любая молекула, которая диффундирует в направлении к центру, находится в области с нулевой концентрацией и в результате седиментирует с максимальной скоростью. Действительно, из формы границы можно получить полное соотношение между 5 и концентрацией для данной молекулы.
Зональное центрифугирование оказывается полезным при определении наличия очень маленьких количеств быстро седимен-тирующего вещества в образце В стандартном методе скоростной седиментации быстро осаждающийся компонент движется через седиментирующий медленно, при этом скорость его движения замедляется за счет эффекта Джонстона — Огстона; это часто не позволяет его заметить. В зональной седиментации такие небольшие фракции седиментируют в области нулевой концентрации, поэтому их легко можно идентифицировать.
Метод зональной седиментации быстро становится популярным в аналитическом центрифугировании ДНК, однако для анализа белков он еще не получил распространения.
Седиментация ДНК при щелочных значениях pH
При высоких значениях pH ДНК денатурирует. Таким образом, денатурированную ДНК можно исследовать в щелочном градиенте сахарозы (т. е. 5—20% сахарозы в 0,1—0,3 М NaOH) *.
Седиментация через щелочной раствор имеет два важных использования: для идентификации одноцепочечных разрывов в двухцепочечной ДНК и для проведения различий между разными конформациями ДНК. В основе идентификации одноцепочечных разрывов лежит следующее соображение: если двухцепочечные молекулы, не содержащие разрывов, разделяются в щелочи, то
* Единственное осложнение при использовании этого метода заключается в том, что сахароза при высоких концентрациях проявляет заметные буферные свойства в диапазоне pH 10—И. Кроме того, ее буферная емкость существенно возрастает с понижением температуры. Таким образом, д.пя приготовления щелочных градиентов сахарозы нельзя применять разбавление буфера с pH 12,5 с последующим прибавлением сахарозы. Чтобы обеспечить денатурацию, pH доводят до нужного значения после добавления сахарозы, причем это необходимо делать при той же температуре, при которой будет проводиться седиментация. Применение 0,3 М NaOH позволяет решить эту проблему. Все щелочные растворы сахарозы должны содержать хелатирующий агент, такой, как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), для предотвращения катализируемого ионами металлов гидролиза фосфодиэфирных связей.
