Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
заметно расширился с применением в качестве исходного материала
протопластов [144]. Впрочем, необходимо отметить, что по некоторым
сообщениям выделение протопластов per se влияет на ряд физиологических
свойств, например на синтез белков [157], метаболизм липидов и жирных
кислот [158-159], выделение Ог и фиксацию С02 [160].
Наиболее чувствительным индикатором функциональной целостности
хлоропластов являются интактность и эффективность процесса ассимиляции
СОг [144]. Чтобы проконтролировать интактность хлоропластов, можно также
воспользоваться любым субстратом, не проникающим через их оболочку. Одно
из наиболее простых и широко используемых для этой цели соединений-
феррицианид, играющий роль окислителя в реакции Хилла. Полноценность
процесса ассимиляции С02 оценивают, измеряя эффективность фотосинтеза
[161].
В качестве маркера для хлоропластов чаще всего используют хлорофилл
[162], но такой тест не позволяет различать ин-тактные пластиды и
свободные тилакоиды. Другие обычно применяющиеся маркеры представлены
ферментами, локализованными в строме, такими, как ферменты
восстановительного лен-тозофосфатного пути (например, NADP+'Зависимая
глицераль-дегидфосфатдегидрогеназа и рибулозодифосфаткарбоксилаза [144]).
11.2. Субфракции хлоропластов
Функционально активные тилакоиды лучше всего выделять из интактных
хлоропластов, поскольку тилакоиды, полученные
96
Глава 2
из гомогената, могут деградировать при выделении. Изолированные
хлоропласты суспендируют в гипотонической среде [163], н образовавшиеся
тилакоиды собирают дифференциальным центрифугированием. Тилакоидные
везикулы с разной ориентацией (вывернутые и с правильной ориентацией)
можно получить из собранных в стопки тилакондов с помощью пресса Yeda с
последующим перераспределением в водной двухфазной системе, содержащей
полимеры [164]. В качестве маркеров для тилакоидов используют как
мембранные компоненты, так и реакции, присущие фотосистемам.
Начало выделению оболочек хлоропластов было положено работой Макендера и
Лича [165]; описана методика выделения ¦высокоочищенной фракции оболочек
из интактных хлоропластов с помощью мягкого осмотического шока с
последующим центрифугированием в непрерывном градиенте плотности сахарозы
[86, 166-168]. Если хлоропласты очищают в градиенте плотности перколла,
их необходимо отмыть до разрушения, иначе можно получить смешанные
фракции мембран [169].
Чтобы разделить внутреннюю и наружную мембраны, хлоропласты суспендируют
в гипертоническом буфере и разрушают, подвергнув несколько раз процедуре
замораживания - оттаивания [170], пропустив через пресс Френча [171] или
использовав стеклянный гомогенизатор [172]. При центрифугировании в
ступенчатом градиенте плотности сахарозы выделяются две фракции оболочек,
отличные от других субфракций хлоропластов. •Ферменты-маркеры для мембран
оболочки описаны в работе [172].
11.3. Этиопласты
Этиопласты обычно образуются в тех случаях, когда ткани, в которых
развитие пластид в норме приводит к образованию хлоропластов (т. е.
листья, стебли), выдерживают в темноте.
Методы выделения этиопластов аналогичны таковым для хлоропластов, за
исключением тех модификаций, которые обусловлены различиями в размере и
плотности. Представленная здесь методика выделения этиопластов из листьев
выращенной в темноте пшеницы основана на центрифугировании грубой фракции
этиопластов в градиенте плотности перколла [173].
1. Собирают листья на рассеянном зеленом свету.
2. Гомогенизируют примерно 35 г листьев в 200 мл среды для выделения (0,5
М сахароза, 10 мМ HEPES, 20 мМ TES, доводят pH до 7,6 КОН) с помощью
гомогенизатора Уоринга на полной скорости два раза по 5 с.
3. Фильтруют гомогенат через восемь слоев хлопчатобумажной марли и один
слой нейлоновой ткани (размер ячеек 15 мкм) и два раза промывают остаток
20 мл среды для выделения.
Мембранные фракции растительных клеток
97
4. Центрифугируют фильтрат в течение 6 мин при 1000 g в угловом роторе
(Sorvall, SS-34).
5. Ресуспендируют грубый осадок этиопластов в среде для выделения и
наносят на градиент перколла, суспендированного в среде для выделения
[25% (о/о)], с подложкой [67% (о/о)].
6. Центрифугируют в течение 20 мин при 1000 g (Sorvall, бакет-ротор с
подвесными стаканами, НВ-4) и собирают этиопласты в слое с концентрацией
перколла 25-67%.
7. Отмызают этиопласты средой для выделения, отцентрифу-гнровав их в
течение 15 мин прн 1000gmax (ротор Sorvall, НВ-4). Повторяют эту
процедуру еще раз.
Чтобы проследить за относительным обогащением этиопла-стами, измеряют
содержание каротиноидов и дигалактозилди-ацилглицеролов [38]. Степень
очистки фракции можно определить с помощью морфометрического анализа
препаратов, подготовленных для трансмиссионной электронной микроскопии:
мембраны этиопластов интенсивно и избирательно окрашиваются ¦при фиксации
водным раствором перманганата [38].
11.4. Субфракционирование этиопластов
Фракцию, содержащую наружную оболочку этиопластов, можно выделить по
