Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
В ранних методиках для выделения и идентификации плазматических мембран
из растительных клеток [59, 46] использовали обработку с помощью ФВК при
низких pH, при которой происходило специфическое контрастирование
мембранных везикул плазматического происхождения. Срезы осадков
мембранных фракций фиксировали, заключали в смолу и исследовали с помощью
электронного микроскопа [31]. Впоследствии для очистки стали использовать
градиенты плотности сахарозы [47, 60-62], водные двухфазные системы,
содержащие декстрин Т500 или полиэтиленгликоль (ПЭГ) 3350. [63-67], а
также изо-электрическое фокусирование [68].
6*
84
Глава 2
7.1. Маркеры плазматических мембран растительных клеток
С плазматической мембраной растений ассоциированы два маркера: 1\+-
стимулируемая, М?2+-зависимая АТРаза, ингибируемая ванадатом [69], и
глюкансинтаза с высокой Км для UDP-глюкозы [47], так называемая
глюкансинтаза II [70]. Кроме того, плазматическая мембрана растений
связывает антагониста полярного транспорта ауксина - N-1-нафтилфталамовую
кислоту (НФК) [71]. Показано, что для серий мембранных фракций из
колеоптилей овса (рис. 2.7) [30] содержание этого
Рис. 2.7. Корреляция между связыванием М-1-нафтилфталамовом кислоты (НФК)
и контрастированием ФВК при низких pH для мембранных фракции из
колеоптилей овса (Avcna sativa) [30].
маркера коррелирует с количеством мембран, специфически контрастируемых
ФВК при низких pH.
При отсутствии подходящих природных маркеров можно ввести искусственные
маркеры (включенная метка) с помощью химической модификации или
специфического связывания. В случае растений такие маркеры вводились
только в плазматическую мембрану протопластов путем ферментативного
иодирования поверхности мембраны с помощью непроникающнх реагентов,
таких, как диазотистая сульфанилиновая кислота или лектины [72]. Впрочем,
достигнутые здесь успехи были не очень значительными из-за отсутствия
однозначных данных о спецн-
Мембранные фракции растительных клеток
85
фичности связывания с поверхностью клетки. Для идентификации
плазматической мембраны протопластов в качестве электроноплотной метки
использовали соединения лантана [73].
7.2. Выделение плазматических мембран с помощью распределения в водной
двухфазной системе
Методика, описанная здесь для гипокотилей этиолированных проростков сои,
аналогична представленной на рис. 2.3 [18, 63] (см. также табл. 1.8).
1. Для выделения плазматических мембран центрифугируют отфильтрованный
гомогенат при 6000 g в течение 10 мин для удаления митохондрий.
Отбрасывают осадок и центрифугируют супернатант 30 мин при 60000g.
2. Суспендируют осадок в 5 мМ фосфате калия, pH 6,8, и используют его как
исходный материал для распределения в двухфазной системе.
3. Готовят двухфазную систему следующего состава: ресус-пендированные
микросомные мембраны (полученные примерно из 40 г ткани), 6,4%-ный (в/в)
декстран Т500 (Pharmacia), 6,4%-ный (в/в) ПЭГ 3350 (Fisher), 0,25 М
сахароза и 5 мМ фосфат калия, pH 6,8.
4. Перемешивают содержимое пробирки, перевернув ее 40 раз. Разделяют две
фазы центрифугированием в бакет-рото-ре с подвесными стаканами при 150g в
течение 5 мин.
5. Дважды промывают верхнюю фазу, обогащенную плазматическими мембранами,
меняя нижнюю фазу на свежую, и разделяют фазы центрифугированием после
каждого перемешивания (переворачивают пробирку 40 раз) (рис. 2.3).
6. Проводят перераспределение мембран между свежей верхней фазой и
исходной нижней фазой, а затем двумя нижними фазами, использованными для
промывания исходной верхней фазы.
7. Объединяют две верхние фазы, содержащие плазматические мембраны,
разбавляют 5 мМ раствором фосфата калия, pH 6,8, содержащим 0,25 М
сахарозу, и центрифугируют при 80 000 g в течение 30 мин.
7.3. Выделение и идентификация тонопластов
Для выделения тонопластов применяют следующие подходы: послойное
автоматическое нарезание тканей [74, 75] или метод, при котором вначале
получают протопласты, а затем подвергают их контролируемому лизису с
помощью осмотического шока [76-80], механического воздействия [81] или
обработки поли-
86
Глава 2
анионами [82]. Целые вакуоли выявляют благодаря их большому размеру с
помощью световой микроскопии и осаждают при очень низких скоростях,
например 1 g [82]. Визуализация вакуолей облегчается тем, что они
содержат природные пигменты [74-76]; кроме того, в среду можно добавить
нейтральный красный, который проникает внутрь вакуолей и обеспечивает их
идентификацию [79, 81, 82]. Как при механическом измельчении, так и при
получении протопластов выход вакуолей, как правило, невысок (<0,5%) [74,
83].
В настоящее время вакуоли из растительных тканей получают в основном
методом, включающим выделение протопластов [84], и хотя способ
механического измельчения имеет то преимущество, что при этом не
возникает опасности разрушения органелл, как при выделении протопластов,
он используется главным образом в случае плотных тканей - таких, как
