Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
положительно или отрицательно заряженными, их связывание может приводить
к изменению заряда белка и соответственно его электрофоретической
подвижности. Способность детергентов изменять электрофоретическую
подвижность белков можно использовать для того, чтобы установить,
действительно ли данный белок содержит протяженные гидрофобные участки и
можно ли считать его типичным мембранным интегральным белком. Мы опишем
достаточно простую методику, которую можно использовать в сочетании с
иммуноэлектрофорезом. Единственное препятствие для ее применения -
склонность белка к агрегации в различных детергентах.
Методика
1. Готовят гели на стеклянных пластинках (10 или 20X Х20 см), используя
1%-ную агарозу в буфере, содержащем 37,5 мМ трис, 100 мМ глицин (pH 8,7)
и 0,5-1% детергента. К нейтральным детергентам относятся тритон Х-100,
октилглю-козид, луброл, эмульфоген ВС720 (наиболее пригоден для данной
методики) и дигитонин; к положительно заряженным детергентам относятся
ЦТАБ (наиболее пригоден для данной методики) и ДТАБ; среди отрицательно
заряженных детергентов наиболее подходящим является дезоксихолат.
Заряженные детергенты обычно используют в смеси с нейтральными
детергентами (в соотношении от 1 : 1 до 1 : 10).
2. Помещают пластины в камеру для электрофореза (если это возможно, то
лучше охлаждать ее водой), содержащую со-
404
Приложение V
ответствующий буфер. Соединяют гель с буфером посредством бумажных
фитилей.
3. Проводят предварительный электрофорез в течение 15- 20 мин при 4-5
В/см.
4. Наносят образцы (10-15 мкл раствора, содержащего 10-20 мкг белка и
детергент в концентрации до 5%) в лунки (1X10 мм), вырезанные в геле.
Стартовая зона должна находиться примерно на равном расстоянии от
ближайших фитилей, особенно если белок слабо заряжен.
5. Проводят электрофорез в течение 2-3 ч при 4-5 В/см.
6. Снимают гель, подсушивают его в потоке теплого воздуха (при этом может
понадобиться закрепить гель), окрашивают белок с помощью раствора,
содержащего 0,1% кумасси синего, 40% метанола и 7% уксусной кислоты, в
течение 1-3 ч и затем отмывают гель в том же растворе, не содержащем
красителя.
7. Белки, связывающие ДОХ и ЦТАБ, должны располагаться ближе к аноду и
катоду соответственно по сравнению с их положением в нейтральном
детергенте, таком, например, как тритон.
Этот метод особенно информативен в сочетании с перекрестным
иммуноэлектрофорезом. При этом электрофорез со сдвигом заряда проводят
вдоль одного края квадратной стеклянной пластинки, как описано ранее.
Затем участок агарозы выше образца удаляют и заменяют агарозой,
содержащей соответствующее антитело и нейтральный детергент. После
электрофореза во втором направлении, проведенного в условиях, подходящих
для перекрестного иммуноэлектрофореза, образуются полосы преципитации,
что позволяет легко выявить сдвиг заряда изучаемого белка.
Литература
1. Helenius A., Simons К¦ (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 529.
2. Norrild B., Bjerrum D. J., Vestergacird P. F. (1977). Anal. Biochem.,
81, 432.
3. Bjerrum O. J. (ed.) (1983). Immunoelectrophoretic Analysis of Membrane
Proteins. Elsevier. Amsterdam.
4. Booth A. G" Hubbard L. M. L" Kenny A. J. (1979). Biochem. J., 179,
397.
ПРИЛОЖЕНИЕ VI
АНАЛИЗ ИНОЗИТОЛФОСФАТОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ
В последнее время благодаря усовершенствованию методов анализа
инозитолфосфатов удалось в значительной мере понять их биологическую
роль. Инозитол-1,4,5-трисфосфат, образующийся из фосфатидилинозитол-4,5-
дисфосфата (рис. 4.6), является вторичным посредником, основная функция
которого состоит в мобилизации ионов кальция из эндоплазматического
ретикулума. Кроме того, инозитол-1,4,5-трисфосфат фосфорили-руется
киназой с образованием инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфа-та, который, по-
видимому, играет роль еще одного вторичного посредника и действует на
плазматическую мембрану, изменяя транспорт кальция [1, 2].
Анализ инозитолфосфатов удалось существенно упростить с развитием метода
ВЭЖХ [3-6]. В этом случае инозитолсодер-жащие фосфолипиды предварительно
метят [32Р]- или [3Н]-ино-зитолом и за образованием меченых
инозитолфосфатов следят с помощью ВЭЖХ, используя сцинтилляционный
счетчик и/илн УФ-денситометр. Если инозитолфосфаты образуются в очень
небольших количествах, единственный способ их определения состоит в
идентификации пиков радиоактивного материала, элюируемого с ВЭЖХ-колонки,
и соотнесении их с положением пиков стандартных образцов. В связи с этим
очень важно убедиться в том, что меченый материал не является примесями,
содержащимися в исследуемой системе.
После стимуляции клеток или ткани ферментативные реакции останавливают
добавлением трихлоруксусной кислоты до концентрации 10%. Полученные
образцы можно анализировать, как описано в разд. 3.3 гл. 4, илн методом
ВЭЖХ (см. ниже).
1. Нейтрализуют образец с помощью трис-основания. 2. Добавляют 100 мкл
50 мМ маннитола, чтобы облегчить извлечение инозитолфосфатов. 3.
