Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
(1 мКи) с помощью ферментсодержащих гранул (разд. 6.1.1 гл. 6). Отделяют
[1261]-РСБ от избытка 1251 на колонке с сефадексом G-75 (60X1 см),
промывая ее 0,2%-ным раствором яичного альбумина, содержащим 20 мМ фосфат
натрия, 150 мМ NaCI, pH 7,4 (буфер PBS). Разбавляют [1251]-РСБ буфером,
используемым для анализа, так чтобы активность 50 мкл раствора составляла
около 50 000 имп/мин (0,2-0,5 нмоля белка).
Буфер для 0,2%-ный раствор яичного альбумина в буфере, со-
анализа: держащем 20 мМ фосфат натрия и 150 мМ NaCI,
РСБ: pH 7,4. 20 мкМ раствор в буфере для анализа, не
содержащем альбумина.
Мембраны Суспендируют мембраны щеточной каемки плацен-
плаценты: ты человека (5,0 мг/мл) [1] в буфере для анализа.
Смесь Смешивают 60 мл дибутилфталата с 40 мл дино-
масел: нилфталата (конечная плотность 1,012; масла по-
лучены от фирмы Aldrich Chemical Co.).
1.2. Методика
1. Берут два комплекта микроэппендорфовских пробирок (Sarstedt 72/702, по
три пробирки на одно определение) и заполняют их наполовину масляной
смесью.
2. Наносят 50 мкл раствора [1251]-РСБ на слои масла.
3. Добавляют по 20 мкл буфера PBS в пробирки комплекта 1 (определение
полного связывания).
4. Добавляют по 20 мкл раствора РСБ в пробирки комплекта 2 (определение
неспецифического связывания).
5. Центрифугируют в течение 15 с при 12 000 g (условия указаны
приблизительно; критерием является просветление слоев).
6. Добавляют по 30 мкл суспензии мембран прямо в инкубационную смесь, не
касаясь стенок пробирки.
7. Инкубируют при 22 °С в течение 15 мин.
8. Охлаждают во льду в течение 2 мин.
9. Центрифугируют в течение 2 мин при 12 000 g в центрифуге типа
Microcentaur.
10. Отсасывают надосадочную жидкость (если необходимо, отбирают аликвоту
для измерения радиоактивности).
11. Срезают у пробирок донышко с осадком н определяют радиоактивность на
^-счетчике.
12. Определяют специфическое связывание, вычитая составляющую для
неспецифического связывания из суммарной величины.
398
Приложение III
2. Растворимые рецепторы
Для анализа солюбилизированных рецепторов также необходимо отделить
связанный радиоактивно меченный лиганд от свободного после того, как
достигнуто состояние равновесного связывания. Для осаждения комплекса
рецептор - лиганд обычно используют полиэтиленгликоль [2]. Осадок,
образующийся после фильтрования или центрифугирования, промывают
растворами, содержащими ПЭГ. Другие методы основаны на связывании
комплекса рецептор - лиганд на ионите или иммуносорбенте (разд. 5.2 гл. 3
или разд. 4 гл. 5). Процедуру промывания недавно несколько модифицировали
(неопубликованные данные) по сравнению с оригинальной методикой так,
чтобы можно было анализировать низкоаффинные и быстро диссоциирующие
системы рецептор - лиганд и даже системы, обладающие малой емкостью.
Такой подход успешно использовали для идентификации и количественного
определения солюбилизированного РСБ-рецептора, который не удавалось
обнаружить с помощью обычных методов (например, гель-фильтрации, PEI-
фильтрации, адсорбции на гидроксилапатите и т. п.).
Описанный здесь метод определения солюбилизированного рецептора в
принципе применим для любой рецепторной системы независимо от константы
аффинности при условии, что найдена такая концентрация ПЭГ, при которой
происходит осаждение комплекса рецептор - лиганд. При этом допустимо
соосаждение до 10% свободного лиганда (фоновый уровень). Образующийся при
добавлении ПЭГ осадок сначала центрифугируют, затем на него наслаивают
смесь масел, содержащую дибутилфталат, и снова центрифугируют. При этом
водный слой, содержащий свободный лиганд, перемещается вверх через слой
масла, благодаря чему удается отделить почти весь свободный лиганд от
осажденного комплекса без нарушения равновесия.
[1251]-РСБ:
РСБ:
Буфер
для
анализа:
Буфер
для
солюбили-
зации:
Солюби-
лизат
мембран:
2.1. Реагенты
См. выше.
Раствор концентрации 50 мкМ в буфере PBS. 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ
NaCI, pH 7,4.
2%-ный нонидет Р40 в буфере для анализа, содержащем 4 мМ MgCl2 и 0,2 мМ
ФМСФ.
К 1 мл суспензии микроворсинок плаценты (10 мг белка на 1 мл) добавляют 1
мл буфера для солюбилизации. Кратковременно перемешивают на вор-
Анализ рецепторов
399
Tf-Г лобу-
лины:
25%-ный
раствор
ПЭГ:
тексе. Инкубируют при 25 °С в течение 20 мин при периодическом
перемешивании. Центрифугируют при 105 ООО g и 4°С в течение 60 мин.
Собирают надосадочную жидкость и, если она не используется сразу, то
хранят ее при -20 °С или во льду. у-Глобулины козы (фирма Sigma), 5 мг/мл
в 0,1 М фосфате натрия, pH 7,4.
25 г ПЭГ 8000 (фирма Sigma) в конечном объеме 100 мл дистиллированной
воды.
2.2. Методика
1. Берут три комплекта эппендорфовских пробирок объемом
0.5.мл (Sarstedt 72/699, по три пробирки на одно определение) и вносят в
каждую пробирку по 50 мкл раствора [1251]-РСБ.
2. В пробирки двух комплектов (комплект 1 для определения суммарного
связывания и комплект 2 для определения фона) добавляют по 30 мкл буфера
