Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Временная экспрессия вирусных генов в эукариотических клетках
После того как были клонированы эукариотические гены и отработаны приемы для введения молекул ДНК прямо в клетки, было обнаружено, что экспрессия многих клеточных генов наблюдается в течение короткого времени после трансфекции [93]. Это явление было названо краткосрочной, или временной, экспрессией. За экспрессией гена следили при помощи иммуно-флуоресценции со специфическими антителами [4] или путем обнаружения мРНК различными гибридизационными методами [42]. Количество клеток, в которых наблюдали экспрессию, колеблется от 1 [93] до 90% [100], причем более обычными были низкие цифры. Экспрессия достигает максимума примерно через 48—72 ч после введения ДНК и через какое-то время становится незаметной. Это, вероятно, связано с утратой молекул ДНК клетками. Использование данного подхода очень полезно для анализа участков, регулирующих экспрессию эукариотических генов; много исследований проведено -и с вирусными генами.
Форма, в которой находится ДНК после ©ведения, подробно еще не охарактеризована. В одной работе показано, что геном
SV40 собирается в хроматин, содержащий н у к л е а з о ч ув с тв и тельные участки около точки начала репликации [54]. По-видимому, после трансфекции ДНК собирается в нуклеосомные структуры подобно тому, как это происходит в ходе литической инфекции. Временную экспрессию использовали для изучения действия позитивных транскрипционных факторов. Предранние гены аденовирусов и вирусов герпеса индуцируют экспрессию вирусных генов в ходе литической инфекции [7, 18, 56, 60, 138]. Для того чтобы показать, что эти гены способны регулировать экспрессию вирусных генов независимо от других вирусных генов, ллазми-ды, кодирующие ген Е1А аденовируса или предранний ген вируса псевдобешенства, трансфицировали совместно с геном, кодирующим ДНК-связывающий 72К-белок (DBP) аденовируса. Оба предравних гена увеличивали транскрипцию гена DBP [53]. Таким образом, эти регуляторные гены кодируют позитивные активаторы, действующие в транс-положении по отношению к гену DBP. Кроме того, эти активаторы могут заменить потребность в энхансерной последовательности, необходимой для высокого уровня экспрессии клеточного гена. Совместная трансфекция с геном Е1А аденовируса или с предранними генами вируса псевдобешенства снимает необходимость энхансерной последовательности для экспрессии гена (3-глобина [2, 39]. Таким образом, эти вирусные активаторные функции могут действовать через нормальные клеточные регуляторные каналы. Временную экспрессию использовали для исследования регуляции экспрессии вирусных генов. Простота системы и быстрота постановки экспериментов делают этот подход удобным и полезным.
Стабильная интеграция вирусных генов с клеточным геномом
Клеточная трансформация представляет собой изменение фенотипа клеток в результате приобретения новых ДНК-после-довательностей [93]. Приобретение вирусных генов клеткой может вести к изменению ее ростовых свойств. Введение в клетки ДНК опухолеродных вирусов ведет к изменениям в росте клеток, и это явление также называют трансформацией. По мере того как число известных механизмов онкогенеза увеличивается, возникает терминологическая путаница, поскольку все они носят название «трансформация». Изменение в ростовых свойствах, вероятно, следует называть ростовой или онкогенной трансформацией клеток лишь в том случае, если изменение фенотипа четко связано с введением новых фрагментов ДНК.
Клеточные линии, стабильно экспрессирующие генные продукты вируса, удобны в качестве клеток-хозяев для поддержания мутантных вирусов, дефектных по специфическим вирусным
генам. Клетки, онкогенно тр а неф ор м и р о-в анн ы е ДНК-содержа-щими вирусами, часто стабильно экспрессируют генные продукты вируса, !и первоначально они служили в качестве пермиссив-ных клеток для мутантов с ограниченным спектром 'хозяев, или вирусов, чьи способности к росту варьируют -в различных клет-ках-хозяевах. Вирусные гены сохраняются благодаря тому, что селективное давление дает преимущество фенотипу трансформированных клеток. Клетки мыши, трансформированные вирусом полиомы, служили в качестве клеток-хозяев для мутантов вируса полиомы с ограниченным спектром хозяев [3]. Эти мутанты чрезвычайно важны для выявления генных продуктов вируса полиомы, ответственного за онкогенную трансформацию (гл. 12). Аналогично этому клетки человека линии 293, трансформированные аденовирусом, стабильно экспрессируют Е 1-участок генома аденовируса [37]. Они служили -в качестве клеток-хозяев для выделения и поддержания мутантов аденовируса по спектру хозяев, что позволило определить функцию продуктов генов Е1А и Е1В [7, 56].
Другие вирусные гены не обладают заметным фенотипическим действием на клетку-хозяина, и поэтому их закрепление в геноме и экспрессия не могут быть непосредственно отобраны. В данном случае их следует вводить 'совместно с селектируемым маркером. Клонировано несколько генов с селектируемым фенотипом, первый из которых — ген тимидинкиназы HSV. Рост клеток на среде ГАТ (ростовая среда, содержащая гапаксантин, ¦аминоптерин и тимидин) требует синтеза клетками тимидинкиназы [66]. Таким образом, клетки tk~ можно трансформировать к фенотипу tk+ включением гена tk HSV с ‘Последующим отбором на среде ГАТ. Селекция на утрату гена tk может быть осуществлена путем роста на среде с бромдезокоиуридином. Вначале было обнаружено, что любая ДНК, введенная в клетку вместе с геном tk в составе одного кальцийфосфатного осадка, оказывается физически сцепленной с этим геном [94]. Эти молекулы, вероятно, соединяются конец-в-коиец после вхождения в клетку и остаются в виде единой молекулы. Отбор на ген tk приводит к отбору и на другие связанные с ним фрагменты ДНК. Таким способом были отобраны трансформанты, экспрессирующие ДНК-связывающий белок аденовируса [40, 114].
