Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В монослопной культуре артефакты при истощении среды могут быть устранены перфузией (Kruse, 1963; Castor, 1968) или частой сменой среды (Griffiths, 1970; YVesterinak, 1971; Skehan, Friedman, 1976). В гелевых культурах слой агара занимает большую часть объема культурального сосуда и не может быть заменен, чтобы пополнить истощенную среду. Хотя небольшой объем среды может быть размещен на поверхности агара, в большинстве случаев этой среды недостаточно для того, чтобы предотвратить развитие артефактов истощения среды. Плотность посева может быть крайне низкой в пробах на КОА, тогда рост будет осуществляться в трех измерениях. В чашке диаметром 60 мм инокуляция 100 клеток со временем удвоения 24 ч приводит к развитию сплошного монослоя приблизительно в течение трех недель; 10 000 этих клеток достигнут того же уровня за 1 неделю, а 100 000 — за 3 дня. В пробах на КОА регистрируемые колонии обычно формируются за 1—4 недели после посадки (Kakanuga, Kamahora, 1968; Dicke et al., 1971; Giard et aL, 1973; Mishra, Byan, 1973; Weiss et al., 1973; Williams et al., 1973; Freedman, Shin, 1974; Berman, 1975; Evans, Di Paolo, 1975; McFarland et al., 1975; Jones et al., 1976; Gallimore et al., 1977; Marshall et al., 1977; Steuer et al.,
1977, 1977b; Colburn et al., 1978; Knowles, Franks, 1978; Barrett et al., 1979; Kahn, Shin, 1979; Montagnier, Gruest, 1979; San et al.,
1979).
В более чем половине литературных источников, по данным которых мы сравнивали КОА, указывается на то, что культуры не питались вовсе. Не было случая, где бы культуры питались 1 или 2 раза в день, как это обычно требуется для предотвращения развития артефактов при истощении среды (Skehan, Friedman, 1976, 1978).
Таким образом, неудачный или скудный рост клеток в мягком агаре может отражать чувствительность к сыворотке или питательным веществам как зависимость от субстрата. В самом деле, клетки BI1K, которые вначале рассматривались как неспособные расти в суспензии в мягком агаре, впоследствии давали высокие значения при определении их КОА в среде с добавлением экзогенных пуринов (Leavitt
38
et al., 1977; Montagnier, 1969; Taylor et aL, 1975). Стимуляция клеточного роста в суспензии с повышенным содержанием питательных веществ и сыворотки была отмечена для других клеточных линий (Eagle, 1959; Eagle et al., 1961; Birch, Pirt, 1970; Higuchi, 1970; Tovey, Brouty-Boye, 1976; Yen et al., 1977). В отсутствие системы контрольных экспериментов, демонстрирующих избыток среды на протяжении исследования КОА, невозможно определить, является ли различие КОА двух клеточных линий результатом различия их зависимости от субстрата или чувствительности к истощению среды.
2.4.4.6. Содержание агара
Содержание агара в пробах на КОА варьирует существенно: от 0,25 до 0,5 % для верхнего суспензионного слоя и от 0,40 до 0,90 % для нижнего антиадгезивного слоя (Kakanuga, Kamahora, 1968; Williams et al., 1973; Freedman, Shin, 1974; McFarland et al., 1975; Gallimore et al., 1977; Ishii et al., 1977; Steuer et al., 1977, 1977b; Montagnier, Gruest, 1979). В общем, высокие концентрации агара задерживают рост и вызывают уменьшение эффективности колониеоб-разования. К примеру, увеличение концентрации агара от 0,25 до 0,275 % подавляет КОА эмбриональных клеток хомячка на 78 % в то же время увеличение концентрации до 0,40 % вызывает уменьшение КОА на 94 % (Kakanuga, Kamahora, 1968). Еще большее ингибирование КОА (на значение около трех порядков) наблюдали у линии лимфомы Беркитта, когда концентрацию агара увеличивали от 0,285 до 0,375 % (Montagnier, Gruest, 1979). В этих исследованиях подчеркивается, что данная клеточная линия может обладать почти любой желаемой КОА (в пределах нескольких порядков ее значений) при варьировании концентрации агара, плотности посева и критериев подсчета колоний.
2АА.7. Другие артефакты
Сообщалось о нескольких других факторах, влияющих на эффективность колониеобразования. Даже в хорошо увлажненных инкубаторах испарение может увеличить осмотическое давление среды и замедлить рост (Carlsson, 1978). Компенсация этого испарения давлением стерильной воды непосредственно в культуральной чашке может увеличить наблюдаемую КОА в 10 раз (Carlsson, 1978). Тип воды, используемой для приготовления ростовой среды и агара, также влияет на наблюдаемые значения КОА. Например, клетки человеческой лимфомы обладают в И раз большей КОА с деионизированной апиро-геттной водой, чем с деионизированной, облученной УФ, дистиллированной (Montagnier, Gruest, 1979).
2.4.5. Резюме
Если сравнительные исследования воспринимались по их номинальному значению, КОА не может рассматриваться как обоснованный индикатор туморогенности широкого спектра, хотя она может иметь предсказуемое значение для клеток определенных видов млеко-
39
питающих. Для клеточных линий крыс и хомячков низкая КОА не показательна при нормальном их статусе, однако доступные данные свидетельствуют о том, что высокая КОА (^* 10 %) может быть индикатором возможной туморогенности. Для клеточных линий мышей и человека в настоящее время не может быть сделано каких-либо заключений о связи КОА и туморогенности, потому что для слишком многих клеточных линий нормальная или трансформированная природа клеток должным образом не установлена. Даже эти ограниченные выводы должны анализироваться с предосторожностью. Данные для клеточных линий с установленным нормальным статусом крайне ограничены, поэтому для клеточных линий крыс и хомячков очевидная корреляция высокой КОА и туморогенности не может рассматриваться как строго доказанная.
