Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2.4.4.1. Определяет ли КОА зависимость от субстрата?
В оригинальных исследованиях Burford и Sanders (1964), MacPherson и Montagnier (1964), в которых клетки ВИК дикого типа имели намного ниже КОА, чем номинально трансформированные клетки ВНК, использовали препараты неочищенного агара как суспензионную среду. Когда эксперименты были повторены с очищенной агарозой, клетки ВНК дикого типа обладали очень высокой КОА, которая в некоторых случаях достигала 50 % и значительно превышала КОА трансформированных вариантов в необработанном агаре (Montag-nier, 1969; Maroudas, 1972). Неспособность клеток ВНК расти в неочищенном агаре, по-видимому, отражает присутствие растворимого ингибитора, который отсутствует в очищенной агарозе (Montag-nier, 1969; Sanders, Smith, 1970). Таким образом, различие линии ВНК и ее трансформированных дериватов не отражает различие субстратной зависимости, а скорее дифференцированную чувствительность к растворимому ингибитору. Более того, мнимо нормальная линия ВНК в действительности — туморогенна (Defendi et al., 1963; MacPherson, 1963; Stoker, MacPherson, 1964; Schoental, 1967; Freedman, Shin, 1974; Berman, 1975; Kahn, Shin, 1979). Как следствие различие двух линий по их способности расти в неочищенном агаре отражает скорее видообразование, чем онкогенную трансформацию.
34
2.4.4.2. Артефакты агрегации
Пробы на КОА могут легко спутать зависимость от субстрата с клеточной адгезивностью. Из клеток большинства типов невозможно приготовить суспензию, состоящую полностью из единичных клеток. В связи с незавершенной диссоциацией или спонтанной агрегацией клеток следом за диссоциацией существует определенный фоновый уровень многоклеточных агрегатов. Этот уровень, являющийся результатом незавершенной диссоциации, обычно составляет 0,1 — 10 % общей клеточной популяции (Kakanuga, Kamahora, 1968; Mishra, Ryan, 1973; Skehan, Friedman, 1975; Wright et al., 1977; Carlsson, 1978).
Спонтанная агрегация, обусловленная клеточным столкновением, до затвердевания агара — высоко вариабельна, зависима от клеточной концентрации, геометрии сосуда, скорости перемешивания, продолжительности нахождения в суспензии перед пассированием и может вовлекать до 50 % всех клеток, и вызывать агрегаты до нескольких тысяч клеток (Skehan, Friedman, 1975; Wright, 1977; Carlsson,
1978). Фоновый уровень клеточных агрегатов часто того же порядка, что и число колоний, которые образуются в пробе на КОА (Kakanuga, Kamahora, 1968; Mishra, Ryan, 1973; Carlsson, 1978). В таких случаях возникает реальный вопрос: развиваются ли колонии из единичных субстратнонезависимых клеток или из агрегатов, клетки которых могут быть индивидуально зависимыми от субстрата. Клетки внутри агрегата могут прикрепляться одна к другой, если эта адгезия удовлетворяет их требованию к субстрату. Затем эти клетки способны пролиферировать в гелевых культурах и (даже больше) формировать многоклеточные колонии, которые не отражают субстратнонезависимый рост и представляют потенциально серьезный источник артефакта в пробах на КОА. Интересно, что Wringt и соав. (1977) продемонстрировали тесную корреляцию тенденции к спонтанной агрегации в суспензии и КОА в метилцеллюлозе для серии опытов, состоящей из 14 клеточных линий грызунов. Чтобы различать истинный субстратнозависимый рост единичных клеток-предшественников и субстратнозависимый рост агрегатов, фоновый подсчет числа колоний агрегатов, содержащих две или более клеток, должен быть сделан на день «0», т. е. немедленно после затвердевания агара, и вычислен из значений КОА, наблюдаемых к концу пробы. Такая поправка обычно не учитывалась.
2АЛЯ. Критерий колониеобразования
В идеальной пробе на КОА все клетки начинают как индивидуальные существа избегать контакта с другими клетками. Когда такая клетка делится и воспроизводит две дочерние, формируется колония. В принципе, любой агрегат, содержащий две или более клеток, должен рассматриваться как колония. Практически этот критерий почти никогда не использовался. Используемые критерии — произвольные и вариабельные. При этом как колонии рассматриваются только
3*
35
те агрегаты, число клеток и диаметр которых превышают некоторые их минимальные значения. Критерии, предположенные в литературе, включают минимальное число клеток, колеблющееся от 4 до 100 (Dicke et al., 1971; Giard et al., 1973; Williams et al., 1973; Freedman* Shin, 1974; Jones et al., 1976; Aden, Knowles, 1977; Gallimore et al.t 1977; Colburn et al., 1978; Barrett et al., 1979; Leong et al., 1979; San et al., 1979), и минимальный диаметр, колеблющийся от 0,1 до
1 мм (Mishra, Ryan, 1973; McFarland et al., 1975; Ishii et al., 1977; Marshall et al., 1977; Steuer et al., 1977, 1977b; Knowles, Franks, 1978; Tucker et al., 1978; Kahn, Shin, 1979; Tatsumi et al., 1979). Многие из этих критериев включают такие большие размеры агрегатов, что большинство колоний (часто очень значительного размера) исключалось из рассмотрения (Kakanuga, Kamahora, 1968; Mishra, Ryan, 1973; McFarland et al., 1975; Carlsson, 1978; Leong et al., 1979). Несомненная КОА, определенная таким образом, часто вызывает предубеждение: она не имеет выраженной связи с истинной колониеобразующей активностью.
