Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
При разработке современного аналитического метода, как правило, стремятся к достижению высокой чувствительности и экспрессности. В связи с этим проведем качественную оценку параметров, в наибольшей степени влияющих на нижний предел обнаружения антигена и длительность анализа.
При рассмотрении будем использовать те же обозначения, что и в конкурентной схеме. Кроме того, обозначим константы скоростей образования и диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигеном соответственно ki и ki* (М_1-с-1); Л-i и k*-i (с-1); Т — время инкубации с меченым антигеном. В рамках принятой модели первая стадия анализа проходит по схеме
Обозначим через п долю центров, связывания антител, заполненных после установления равновесия с антигеном, т. е. л[Ат]о= =[АтАг]=[Ат]о—[Ат] или п=\—[Ат]/[Ат]0. Выразив в уравнении (9.19) [АтАг] через ([Ат]0 и представив равновесную концентрацию свободных центров связывания антител и антигена как разность начальной концентрации и концентрации комплекса, получим
к
Ат-|-Аг-.—- АтАг; АТ[Ат] [Аг] = [АтАг].
(9.19)
Возможность определения данной начальной концентрации антигена в методе последовательного насыщения зависит от степени насыщения антител. Если при взаимодействии с антигеном заполняется очень малая часть центров связывания, то после добавления меченого антигена регистрируемый сигнал в пределах ошибки изменения не будет отличаться от сигнала в отсутствие
определяемого антигена. Учитывая точность, характерную для проведения анализа, можно приближенно принять, что достоверное определение концентрации антигена будет осуществляться как минимум при 10%-ном заполнении центров связывания (л= = 0,1) и максимум при 90%-ном заполнении (л—0,9). Характерная кривая титрования приведена на рис. 39. Соответствующие этим степеням заполнения начальные концентрации антигена [Аг]Мин и [Аг] макс, по существу, являются минимально и максимально определяемыми для данного метода, причем [Аг]мин фактически отражает нижний предел обнаружения антигена.
Подставляя численные значе-чения п в выражение (9.20) и округляя, получаем:
Рнс. 39. Характерная кривая титрования, получаемая в результате проведения первой стаднн ИФА по методу последовательного насыщения:
по оси абсцисс — концентрация определяемого антигена; по оси ординат — концентрация свободных центров связывания антител; ArmIn и Агтах — концентрации определяемого антигена, прн которых степень. заполнения аитнтел антигеном (п) составляет 10 и 90% соответственно
[Аг]мин^0,1([Ат]0+-^): (9.21)
[Аг]макс^[Ат]0+^-. (9.22)
К
Выражение (9.21) иллюстрирует логически понятное положение о необходимости использования для детекции низких концентраций антигена высокоаффинных антител. Из этого же выражения следует, что для снижения абсолютного значения [Аг]МШ1 (т. е. для повышения чувствительности) необходимо снижать концентрацию Iatjo до примерно равной обратной константе связывания 1/К-Дальнейшее снижение [Ат]0 нецелесообразно, так как в пределе может привести только к двукратному уменьшению [Аг]Мии, что в большинстве случаев непринципиально. В то же время возможность уменьшения [Ат]о лимитируется чувствительностью детекции Метки, концентрация которой в комплексе с антителами, очевидно,
не может превышать [Ат]о. С уменьшением [Ат]0 будет также возрастать и время достижения равновесия на первой стадии.
На практике часто возникает необходимость измерения концентраций антигена, значительно превышающих значение 1/К-В этом случае целесообразно проводить первую стадию в кинети: ческом режиме, что существенно снижает и длительность анализа в целом, или же прибегать к разведениям исследуемых образцов.
Сравнивая (9.21) и (9.22), нетрудно заметить, что при изменении [Ат]0 значительно меняется ширина рабочего диапазона. Если при малых концентрациях ([Ат]0С 1//С) она составляет два порядка (0,1//С-Т-10//С), то при больших — только один (0,1[Ат]о-г-[Ат]о). В ряде случаев (в зависимости от изменения содержайия антигена в биологической жидкости) увеличение рабочего диапазона определяемых концентраций может быть целесообразным. Но следует учитывать, что это приводит к некоторому увеличению относительной погрешности вычисления концентрации антигена за счет уменьшения крутизны калибровочной кривой.
Качественно рассмотрев некоторые закономерности анализа на первой стадии, перейдем к анализу ситуации, возникающей после удаления несвязавшихся компонентов и добавления в систему меченого антигена. При этом в рамках принятой модели идут два процесса: связывание меченого антигена свободными активными центрами антител и диссоциация образовавшегося на первой стадии специфического комплекса по следующей схеме:
**
1
Ат-f-Ar*,-—АтАг* (9.23)
АтАт-*—Ат-f-Ar (9.24)
Схема описывается системой уравнений:
d[ArAv] =^^АтцАг]_^_1|АтАг1 (9.25)
