Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
[д , К* [Ат]0 [Аг*]0 1 К* [Ат]р
1 К [АтАг*] К
---1 + К* [Аг*]_ + [Атj----[AlА?У-----[АтАг*]. (9.8)
к Т1 ю Д’* [Аг*] 1 '
В соответствии со схемой анализа максимальная концентрация комплекса [АтАг*] (а следовательно, и максимальный регистрируемый сигнал) образуется в отсутствие определяемого антигена ([Аг]0=0).
Таким образом, за нижний предел обнаружения антигена следует принимать его концентрацию, способную вызывать достоверно регистрируемое изменение сигнала (рис. 30), где В* — концен-
трация комплекса [АтАг*] в отсутствие определяемого антигена; S* — фактор, характеризующий относительную ошибку определения величины В*, [Аг]0мип—минимально детектируемая концентрация антигена или предел обнаружения.
Если калибровочная кривая имеет гиперболический вид, как на рис. 31, то начальный участок кривой при малых значениях [Аг]о' можно считать линейным. Для установления предела обнаружения необходимо проанализировать на этом участке произ-д [АтАг*1 водную- 1 ----•
д [Аг]0
д [Аг]„
= S*B*-
[Аг]0
прн [Ат]0-о [Аг*]
• (9.9)
САг*]-[Аг*]о-В* 4 ’
(9.10)
С учетом выражения (10.8) получаем
[Аг]0мни=5*В*( 1---+--------------------!-----+
1 J 1 К К* ([Аг]о — В*)2 '
К* [Аг*]0 [Ат]0 _I)
"1“ К (В*)2 J '
При отсутствии определяемого антигена ({Аг]о=0) из уравнения
(9.3) следует:
[ДГ.] =... [A.WA.] , g 1Ат], - [АТ],^ = _в._
AC*[Ai] К* [Ат]р К' [Л г]р ' ’
где [At]f=[At]o—В* — концентрация свободных центров связывания антител при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена.
Подставляя из (9.11) значение [Аг*] в уравнение (9.4), получаем
|Аг’1“=~кчЬ7+в’ (9л2>
Подставляя полученное выражение (9.12) в уравнение (9.10), после несложных преобразований будем иметь:
[Аг]0мнн= S |[Ат]0 (-И1|о-+УС*[Ат]р+/ГЛ'*[Ат]Р2|. (9.13)
Минимальное значение правой части уравнения (9.13), равное S/К и соответствующее предельной чувствительности для кривой титрования, достигается при выполнении следующих условий:
[Ат1о<-1; -^-«1; [Ат]Р/<*<^1; КК*\At]|^1,
К LATJp
так как [Аф=[Ат]0—В*, то условие [At]0«{At]f адекватно условию В*<с[Ат]0, a [Ат]*К*<С1 — условию [Ат]0<^-^-
• Таким образом, для максимального приближения калибровочной зависимости к -кривой титрования концентрация центров связывания должна быть меньше констант диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигенами, а степень заполнения антител меченым антигеном должна быть крайне низкой. Последнее положение логически понятно, так как влияние
. меченого антигена на связывание определяемого антигена должно быть пренебрежимо мало. Однако реально это требование трудно выполнимо из-за сложности достоверной регистрации изменения концентрации метки в комплексе с антителами при варьировании концентрации определяемого антигена. Если считать достаточно малыми такие значения параметров, при которых нижний предел детекции антигена увеличивается вдвое по отношению к минимальному и составляет 2/К, то рассмотренные выше условия следует записать в виде
1Ат1о<^; [Ат]0< (9.14)
• Таким образом, начальная концентрация центров связывания должна быть меньше значения константы диссоциации комплекса антиген — антитело (если эти значения для меченого и определяемого антигенов различны, то минимальной из них), а концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена им заполнялось не более половины центров связывания антител.
Из рассмотрения изотермы связывания меченого антигена с антителами следует, что условия В*<[Ат]о/2 и [Ат]0<1//С* могут выполняться одновременно только при [Аг*]0< l/К*. Если популяция антител гетерогенна по аффинности к антигену, то концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы условие В*<[Ат]о/2 выполнялось для высокоаффинной фракции антител, определяющей чувствительность анализа.
В ^зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства может наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате кон-формационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей.
Следует отметить, что в идеальном случае, при котором предполагается наличие молекул антител строго одной аффинности и отсутствие неспецифических взаимодействий, одинаковая чувствительность может быть достигнута при любых соотношениях меж-
