Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- Во избежание перекрестных загрязнений и попадания РНКаз при
взвешивании реактивов не следует пользоваться шпателями.
- Большинство растворов перед хранением автоклавируют; те растворы,
которые необходимо стерилизовать фильтрованием, отмечены в тексте.
- Концентрированные растворы рестриктаз и других ферментов,
модифицирующих ДНК, следует хранить при -20°С, а непосредственно перед
употреблением перенести в лед. Оставшиеся ферменты сразу же следует
поместить в холодильник на - 20 °С.
- Для уверенности в точности и воспроизводимости используют
микродозаторы Gilson, регулярно проверяя их точность и меняя наконечники
перед каждой операцией.
- Два часто используемых вещества, фенол и бромистый эти-дий,
чрезвычайно опасны, их необходимо применять очень осторожно. Пятно
фенола, покрывающее участок кожи размером в две ладони, может быть
опасным для жизни, поэтому важно всегда иметь под рукой раствор ПЭГ
3000/этанол (7:3, вес на объем), которым необходимо сразу же обработать
пораженную поверхность. Бромистый этидий является мутагеном и его
контактов с кожей следует избегать.
- Радиоизотопы следует приобретать и использовать согласно существующим
санитарным нормам. Прежде чем планировать эксперименты с использованием
радиоизотопов, ознакомьтесь с правилами работы с открытыми радиоактивными
источниками и включите в протокол соответствующие меры безопасности.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 39
1.3. Культивирование и хранение бактериальных штаммов
Чтобы избежать получения неоднозначных результатов, чрезвычайно важно
уметь надежно сохранять и вести селекцию специальных бактериальных
штаммов (приложение 1 [НА]). Ниже описаны основные бактериологические
методики конструирования рекомбинантных векторов для трансформации
растений. Большинство бактериальных штаммов несет специфичные селективные
маркеры, часто внехромосомные; сохранность маркеров следует регулярно
тестировать, чтобы избежать возможной контаминации, мутации или утраты
специфичных плазмид. Многие штаммы будут использоваться часто, тогда как
другие от случая к случаю; таким образом, необходимы методы как быстрого
размножения генетически чистых бактериальных колоний, иопользуемых в
качестве инокулята для засева культур больших объемов, так и длительного
хранения важных штаммов. В приложении 1 [II В] приведены среды для
селекции часто используемых бактериальных штаммов.
1.3.1. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Большинство наименований необходимого оборудования и приспособлений
представлено в приложении 1 [I].
- Холодостойкие пробирки для хранения с завинчивающимися крышками
емкостью 2 мл (Sarstedt). -
- Микрошпатель (по ширине меньший диаметра пробирок для хранения).
- Небольшой сосуд Дьюара для жидкого азота.
Растворы
- Питательный бульон (NB, Nutrient Broth, Oxoid); эту среду
!пригота;вливают согласно рекомендации изготовителя, авто-клавируют и
разливают в следующие емкости:
по 5 мл в стандартные пробирки для ночных культур,
по 80 мл в колбы емкостью 100 мл для культур небольшого
объема,
по 400 мл во флаконы емкостью 500 мл для культур большого объема.
- Питательный агар (NA, Nutrient Agar, Oxoid); эту среду следует
приготовить согласно рекомендациям изготовителя, довести до кипения для
полного растворения, отмеренные объемы разлить по удобным для заливки
чашек Петри емкостям и автоклавировать.
40
I лава 1
- Концентрированные растворы антибиотиков (ом. приложение 1 LII В]).
- 40%-ный раствор глицерина в NB (автоклавировать).
- X-GAL: растворяют 5-бро'м-4-хлор-3-индол-р-0-галактош1ра-нозид (BRL) в
диметилформамиде в концентрации 40 мг/мл и хранят при -20 °С.
- ИПТГ: растворяют изопропил-р-О^тиогалактопиранозид
(Pharmacia) в стерильной воде в концентрации 40 мг/мл и хранят при -20
°С.
1.3.2. Наращивание ночных бактериальных культур
1. С помощью раскаленной и охлажденной микробиологической петли (ее
нагревают в пламени горелки до ярко-крас-ного цвета, а затем дают остыть
до комнатной температуры) переносят отдельную бактериальную колонию со
свежей чашки, содержащей селективные антибиотики, в пробирку с 5 мл NB,
содержащей те же антибиотики.
NB: соблюдайте стерильность!
2. а) Е. coli: инкубируют 8-16 ч при 37 °С с аэрацией, используя
термостатируемую качалку с круговым вращением (амплитуда 5-Ю см и
скорость вращения 150-200 об/мин), б). Агробактерии: наращивают 20-48 ч
при 28 °С с помощью аналогичной качалки.
1.3.3. Рассев бактериальных культур для получения
отдельных колоний
1. Помещают стерилизованную в пламени горелки микробиологическую петлю в
ночную культуру и проводят несколько штрихов по поверхности подсушенной
агаризованной среды (с соответствующими селективными антибиотиками) в
чашке Петри диаметром 9 см, как показано на рис. 1.8. Между проведением
первого и второго штрихов проносят петлю через пламя.
2. Если возможно, слегка приоткрывают крышку чашки и подсушивают
