Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
использовать pGV3850 (разд. 1.1.7.1 и рис. 1.4) [61J. На рис. 1.7
представлена последовательная схема, описывающая различные этапы инсерции
чужеродной ДНК в плазмиду pBinl9.
Методы, используемые для встраивания генов в pBinl9, применимы ко
многим другим трансформирующим векторам растений общего типа, за
исключением, может быть, возможности скрининга на X-GAL/ИПТГ, которую
дают не все векторы. Кроме очевидных различий в сайтах узнавания
рестриктазами, используемыми для клонирования, и в маркерах устойчивости
к антибиотикам, используемых для селекции трансформантов Е. coli и
агробактерий - трансконъюгантов, важно иметь в виду и присутствие в
трансформирующем векторе растений последовательностей ДНК, необходимых
для его мобилизации подхо-
Препаративное выделение плазмиды в большом объеме (разд. 1.4)
Препаративное выделение плазмиды в
большом объеме (разд. 1,4)
2,7 т.п.н.Г
Электрофорез в агарозном геле (разд. 5.3) Вырезают фрагмент длиной 4,6
т.лл. и извлекают из геля методом электрозлюции (разд. 1.5.4)
Щелочная фосфатаза из кишечника теленка (разд. 1.5.3)
н*е
'(я вам Г
fd
Лигируют (разд. 1.6),переносят в JM83 и отбирают белые колонии на NA + Km
+ X-GAL +ИПТГ (разд. 1.7)
Характеризуют плазмиду с помощью рестрикционного анализа (разд. 1.9}
мини-препарата ДНК (разд. 1.8). Мобилизуют плазмиду в агробактерии в
трехродительском скрещивании (разд. 1.10) и провернют конструкции
тотальной ДНК агробактерий с помощью блоттннг-гибридизации по Саузерну
(гл. 5)
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 37
дящей плазмидой-помощником и переноса путем конъюгации (разд. 1.10). Для
некоторых специальных векторов могут потребоваться другие варианты
основных методик, и в этом случае читателю придется обратиться за
подробностями к оригинальным публикациям (разд. 1.1.9). И наконец, в
заключение следует сказать, что многие упомянутые в данном руководстве
векторы для трансформации растений, селектируемые и скринируе-мые
маркерные гены, штаммы-помощники wir-функций и конъюгации свободно
доступны. Интересующимся исследователям следует обращаться за векторами и
штаммами-помощниками непосредственно в лаборатории, в которых они были
получены.
1.2. Общие молекулярно-биологические рекомендации
Для полной уверенности в том, что ферментативные реакции происходят
предсказуемо и воспроизводимо, пробы не содержат примесей других,
неспецифичных нуклеиновых кислот и нужные молекулы ДНК не деградируют во
время манипуляций, необходим опыт практической работы. Источником
значительных нук-леазных загрязнений может быть кожа рук и,
следовательно, необходимо принимать меры предосторожности от возможного
загрязнения. Ниже перечислены некоторые общие указания и методы, цель
которых - по возможности свести к минимуму загрязнение нуклеазами,
неспецифическими ДНК и посторонними веществами.
- Если растворы готовят и хранят в стеклянной посуде, то следует
использовать гтирекс, поскольку натриевое стекло содержит выщелачиваемые
примеси.
- Стеклянные и пластиковые центрифужные пробирки следует вымыть
хромпиком, замочить и вымыть щеткой в присутствии поверхностно-активного
детергента, например Decon 90 (De-con Labs Ltd.), тщательно ополоснуть
бидистиллированной водой, автоклавировать 15 мин при 121 °С и высушить
перед использованием.
- Супернатанты после центрифугирования бактериальных культур сливают в
специальную посуду, содержащую дезинфицирующее вещество (например,
Hycolin, William Pearson Ltd.). При повторном использовании загрязненной
пластиковой или стеклянной посуды перед мытьем ее следует замочить в
дезинфицирующем растворе или автоклавировать. Все многократно
используемые приспособления, загрязненные в про-
Рис. 1.7. Клонирование генов в pBin 19. Схематическое изображение
стратегий клонирования, позволяющего вставить Яг'тДИ-фрагмент (4,6 т. п.
н.) СаМV-cat из- pUC18CaMVCAT в tfiWIlI-сайт плазмиды pBinl9. *Н - дефос-
Форилироваиныи ЯшШЬкоиец фрагмента ДНК. (ВМЦК тождественно CaMV.)
38
Глава 1
цессе контакта с суспензиями или экстрактами бактерий, перед
повторным использованием следует простерилизовать.
- Все стекло, предназначенное для манипуляций в непосредственном
контакте с РНК-содержащими растворами, перед использованием, кроме
описанной выше процедуры мытья, следует силиконировать и прогреть в
суховоздушном шкафу при температуре 180 °С в течение 2 ч.
- Одноразовые пластиковые наконечники и микроцентрифужные пробирки
перед использованием необходимо автоклави-ровать, высушить и перенести в
удобные штативы, иопользуя при этом чистые одноразовые перчатки.
- В течение всего времени работать за столом следует в сменных
перчатках.
- Для приготовления растворов следует использовать воду высокой
чистоты, как минимум, деионизованную и дистиллированную.
- Для приготовления растворов необходимо использовать реактивы по
крайней мере квалификации ХЧ (analytical grade).
