Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
свежей ночной культуры TR5989 (ригВ\2) и ряд объемов (0,01-0,1 мл) фага
Р22, выращенного на пуле мутантов со случайными вставками Тп 10.
Приготовьте около 10 таких чашек. Инкубируйте при 37°С до тех пор, пока
колонии трансдуктантов не вырастут настолько, что их можно будет
перепечатывать (36-48 ч).
8. Перепечатайте колонии с трансдукционных чашек на чашки Е+ЭГТА и на
чашкиЕ + ЭГТА+тетрациклин (10мкг/мл). Инкубируйте при 37°С столько
времени, чтобы можно было сравнить рост на этих чашках (24-48 ч).
9. Выявите тех трансдуктантов, которые выросли и на чашке Е, и на
чашке Е4-тетрациклин. Отберите уколом трансдуктан-
26
Раздел I. Эксперименты
тов с чашек, содержащих тетрациклин, и рассейте штрихом до отдельных
колоний на индикаторные чашки Green-Ьтетра-циклин. Отберите и рассейте по
возможности 10-20 таких трансдуктантов. Инкубируйте чашки со штрихами при
37°С до тех пор, пока колонии не вырастут настолько, что проявится их
окраска (18-24 ч).
10. Из каждого штриха отберите уколом хорошо изолированную
бледноокрашенную колонию и засейте ею небольшой объем среды LB (1,0 мл).
11. На чашку Green поперек штриха фага Р22 (с2) нанесите штрихами каждую
из полученных культур/чтобы проверить их чувствительность к фагу.
Проверка сцепления ТпЮ с мутацией ригВ12
12. Вырастите культуру TR5989.
13. Используя фаги, выращенные на каждом из штаммов с предполагаемой
вставкой Тп 10 вблизи ригВ, проведите трансдукцию клеток TR5989 (ригВ 12)
к устойчивости к тетрациклину. Смешивайте по 0,01-0,1 мл фага и 0,1 мл
свежей ночной культуры TR5989 на поверхности чашек LB-[-тетрациклин (20
мкг/мл). Инкубируйте 24 ч при 37°С.
14. Каждую трансдукционную чашку перепечатайте на среду Е +тетрациклин +
ЭГТА и на среду Е + аденин + тетрацик-лин + ЭГТА. Инкубируйте чашки-
реплики при 37°С/(24- 36 ч) .
15. Подсчитайте долю трансдуктантов TetR, являющихся одновременно Ade+.
Заложите на хранение культуры тех штаммов, которые показали достаточно
тесное сцепление (более чем 10% совместного наследования Ade+ и TetR).
Для этого вернитесь к той чашке, на которой сохранились исходные
чувствительные к фагу штаммы с Тп70. Отберите клетки тех штаммов, у
которых вставки Тп 10 оказались сцепленными с геном риг В12, посейте их в
столбики для хранения. Занесите эти штаммы в журнал с указанием процентов
ко-трансдукции вставок Тп 10 с мутацией ригВ.
Обсуждение
1. Это можно сделать одновременно с проведением транспозиции в
эксперименте 1.
2. Важно, чтобы во все среды, используемые для суспендирования и
выращивания этих пулов, был добавлен ЭГТА. В этих средах содержится
некоторое количество фага, и если не окажется ЭГТА, то он
сможет_размножаться. Смысл этого в том, чтобы во время подращивания пула
возникали и персистировали чувствительные к фагу клоны. Полученный таким
способом пул из примерно 10 000 клонов с транс-
2. Выделение вставок Тп 10 вблизи определенных генов
27
позициями включен в набор штаммов. Его следует выращивать в присутствии
ЭГТА и хранить при -70°С. При использовании его для размножения фага с
ним следует обращаться так, как это описано ниже.
3. Проводят промывки, чтобы удалить ЭГТА из препарата, используемого для
размножения, трансдуцирующего фага Р22 на пуле клеток. Среду Е применяют
потому, что она содержит кальций. Вероятно, можно применять и любой
другой буфер с кальцием. Суспензию промытых клеток-можно хранить при
низкой температуре и позднее использовать ее как источник мутантов
(методы хранения см. в приложении 3). Используемый в этом и в других
экспериментах по общей трансдукции штамм фага Р22 несет две мутации:
мутацию int~ (предотвращает интеграцию и образование стабильных
лизогенных бактерий) (Smith, Levine, 1967) и мутацию НТ (обусловливает
повышенную частоту упаковки в фаг хромосомы клетки-хозяина) (Schmieger,
1972). Эти мутации обеспечивают высокие частоты трансдукции и позволяют
получать трансдуктантов, не являющихся лизогенными по фагу Р22. На этой
стадии пул мутантов, несущих вставки, можно заморозить, чтобы
использовать его в будущем (см. приложение 3).
4. Фаг Р22 в бульоне (см. методику 3) вполне стабилен даже при комнатной
температуре, но обычно его хранят при 4°С. Лизис при размножении фага
можно обнаружить по просветлению культуры или по появлению нитей обломков
клеток. Даже если и не заметно видимых признаков лизцса, все равно таким
способом получаются препараты фага, йригод-ные для использования.
5. После перемешивания с хлороформом в смесителе Vortex суспензию лучше
оставить при комнатной температуре на несколько часов или на ночь, чтобы
повысить гибель клеток от хлороформа. После этого суспензию (с
хлороформом) следует хранить при 4°С.
6. (Этап 7); используют'несколько концентраций фага, чтобы компенсировать
непостоянство титра фага в донорном лизате и вариации в эффективности
трансдукции штамма-реципиента.
7. (Этап 8); важно, чтобы на этих чашках-репликах сохранились селективные
условия (среда Е), так как в противном случае сможет расти исходный
