Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
хвостовых отростков фага Р22 используется штамм Р22-503 (с 1-7 72amN114
/ЗатНКН), а в качестве его хозяев - штаммы Salmonella TR248 (cysA1349 am
/i/sC527am) и TR251 (dsA1349am /nsC527am supD [sul+]).
А. Получение хвостовых отростков
1. Вырастите препарат фага Р22-503 на клетке-хозяине TR251 (методики 2 и
3).
2. Проверьте концентрацию ревертантов, высевая полученный препарат фага
на штамм TR251 (пермиссивный для амбер-мутантов) и на штамм TR248
(непермиссивный для амбер-мутантов).
3. Вырастите 2 л культуры TR248 в бульоне LB при 37°С до плотности ~2-108
клетка/мл.
4. Заразите фагом Р22-503 с множественностью заражения 5 фагов на клетку.
5. После заражения инкубируйте в течение 90 мин при 37°С со
встряхиванием.
6. Осадите зараженные клетки цетрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) и
ресуспендируйте их в физиологическом растворе (Vioo исходного объема).
7. Лизируйте клетки, добавив хлороформ и интенсивно встряхивая.
8. Обработайте ДНКазой (10 мкг/мл) в течение 10 мин при комнатной
температуре.
9. Отцентрифугируйте препарат в течение 15 мин при 5000 об/мин, чтобы
удалить обломки клеток.
10. Чтобы удалить все целые фаговые частицы, центрифугируйте в течение 2
ч при 17 000 об/мин. Проведите повторное центрифугирование. Каждый раз
собирайте надосадочную жидкость и отбрасывайте осадок.
11. Проверьте надосадочную жидкость на содержание в ней ин-тактного фага,
высеяв ее на газон TR251. Фага должно содержаться менее чем 104 БОЕ/мл.
Б. Присоединение хвостовых отростков к головкам
Смешайте суспензии отростков и головок фага и инкубируйте в течение 2 ч
при 30°С. Проводя высев, следите за нарастанием титра фага. Чтобы
насытить - 5-1012 головок, полученных при индукции культуры NK337 объемом
1,5 л, ис-
5. Транспозиция элемента Тп 10
69
пользуйте препарат отростков фага, полученный из культуры объемом 2 л.
III. Транспозиция при трансдукции
1. Вырастите реципиентные клетки в бульоне LB до плотности 5-108
клетка/мл.
2. С помощью центрифугирования (5000 об/мин, 10 мин) сконцентрируйте
клетки в 10 раз (ресуспендируйте осадок в 7ю исходного объема).
3. Заразите фагом с множественностью заражения 0,8 частицы на клетку.
Проведите адсорбцию в бульоне LB в течение 30 мин при 37°С.
4. Высейте зараженные клетки на чашки Green + тетрациклин (25
мкг/мл)+ЭГТА (10 мМ). Чашки инкубируйте при 4ГС. Переколите колонии и
выявите среди них мутантов.
5. Колонии TetR должны появляться с частотой 1 на 105-10б зараженных
клеток. Если используется описанная выше методика и если считать, что
добавляется очень небольшой объем фага, то 0,1 мл зараженных клеток
приводит к образованию 200 колоний TetR. Около 1% клонов TetR оказываются
аукстрофами.
Обсуждение
I. Эта методика получения дефектного трансдуцирующего фага описана
Клекнером и др. (Kleckner et al., 1975). Фаг получают при индукции
лизогенного штамма NK337 под действием высокой температуры. Генотип
штамма NK337: hisC527 /еи-414 supE (Р22 c2ts29 12 amNll 73ашН101 int-
ЪЧпЮ).
Имеющийся в этом штамме супрессор супрессирует ам-бер-мутации в генах 12
и 13 фага. Индукция при 40°С происходит из-за мутации c2ts29. Мутация в
гене int фага обусловливает высокую частоту неправильного вырезания
профага, и в результате фаги получаются дефектными, но включают элемент
'Гп 10.
II. Методика транспозиции при трансдукции основана на том, что клетки
заражают фагом, с Тп 10 таким образом, что интеграция транспозона в
результате лизогенизации или в результате обычной рекомбинации
оказывается невозможной. Фаг, несущий Тп 10, является c2ts, и поэтому при
высокой температуре не может установиться состояние репрессии. Этот фаг
также мутантен по генам 12 и 13, так что в ре-ципиентных вгш-клетках
происходит лишь очень незначительная репликация такого полного фага.
Наконец, мутация int~ приводит к тому, что большинство фагов в препа-
70
Раздел II. Методики
рате оказывается дефектными из-за неправильного вырезания (см. выше
разделы о выращивании дефектного фага Р22 и соединении его с отростками).
Мутация int~ у ре.ципиента препятствует также интеграции генома любого
фага, избежавшего действия указанных выше рестрикций. Предотвращается
также и гомологичная рекомбинация, так как транспозон Тп 10 встроен в
геном фага, а используемый реципиент не содержит фаговых
последовательностей.
Трансдукционные чашки содержат ЭГТА, который хела-тирует ионы Са2+ и тем
самым препятствует адсорбции фага. В результате предотвращается
размножение на транс-дукционной чашке жизнеспособного фага. Использовать
чашки Green не обязательно, но они недороги и позволяют выявлять те
колонии, в которых размножается фаг (такие колонии оказываются темно-
зелеными). Незаряженные колонии и колонии стабильных лизогенов
оказываются бледно-окрашенными.
Литература
Israel J. V., Anderson Т. F., Levine М., 1967. In vitro morphogenesis of
phage P22 from heads and base-parts, Proc. Natl. Acad. Sci., 57, 284.
Kleckner N., Chen R., Туе B.-K-, Botstein D., 1975. Mutagenesis by
