Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Участки активного центра сериновых протеаз, ответственные за связывание С-концевого фрагмента субстрата (уходящей группы), были идентифицированы при изучении комплексов трипсина и химотрипсина с природными белковыми ингибиторами сериновых протеаз. Такими участками являются дисульфидная связь 42-58 (химотрипсин), область рядом с остатками Hls40 и Gly193, а также остаток Туг151 (в трипсине).
Важное значение для активности сериновых протеаз имеет ионная пара, образуемая в ферменте карбоксилат-ионом Asp194 и аммонийной группой 11е16. Эта ионная пара может рассматриваться как регуляторный участок фермента. Она отсутствует в зимогенах и образуется при активации последних. При этом, как полагают, происходит окончательное формирование активного центра фермента. Изменение pH в щелочную область приводит к разрушению ионной пары и переходу фермента в новую, неактивную конформацию.
Описанное выше строение активных центров сериновых протеиназ характерно с небольшими вариациями для всех изученных ферментов этой группы. Показательно в этом отношении состояние активного центра в суСтилизинах и других микробных сериновых протеиназах. Как уже отмечалось, отсутствует гомология в первичной структуре субтилизинов и панкреатических ферментов. Отсутствует также сходство в пространственной структуре в целом. Однако строение активных центров у этих двух типов сериновых протеиназ очень сходное. Основные различия химотрипсина и субтилизина заключается в том, что "тозильная яма" в первом случае представляет собой узкий карман, в котором положение ароматической группы субстрата жестко фиксировано. Во втором случае аналогичный участок преДставляет собой щель, с одной стороны доступную растворителю. Таким образом, ароматическое кольцо субстшта в комплексе с субтилизином взаимодействует с ферментом лишь одной стороной Иззо].
Другое отличие заключается в отсутствии у субтилизинов кислого остатка
гомологичного Asp194 в химотрипсине. Соответственно N-концевые последовательности этих ферментов отличаются от последовательностей сериновых проте-аз животных.
2.6.2 Цистеиновые аиидгидролазы
Представители этой группы ферментов инактивируются реагентами, взаимодействующими с тиоловыми группами - п-хлормеркурибензоатом И 3311, йодацетатом и йодацетамидом [1332] и т.п. Было показано, что при инактивации реагирует одна SH-группа остатка Cys25 [13331 (нумерация последовательности папаина). Этот остаток локализован у большинства ферментов животных (калпаины, ка-тепсины В, L и др.) и растений (папа-ин, актинидин, химопапаин и др.) в последовательности Gly-Xaa-Cys-Trp, где Хаа - разные для разных ферментов остатки. У микробных цистеиновых протеаз (стафиллококовой протеазы, клострипаи-на) эта последовательность несколько отличается [720,726,728,735,747,752,
1334-1336]. Рентгеноструктурный анализ папаина и актинидина показал, что этот остаток расположен в протяженной щели на границе двух доменов фермента (рис.25). Он может быть превращен в дегидроаланиновый или глициновый остатки с полной потерей активности [1337]- В непосредственной близости к SH-группе располагается имидазольная группа остатка H1S159, N®1-атом которого образует с SH-группой Cys25 водородную связь. Второй Ne2-aTOM Hls159 образует водородную связь с 0е1-атомом остатка Asn182. Эта водородная связь расположена в неполярном окружении и защищена от контакта с растворителем индольным кольцом Тгр184. Роль остатка Hls159 в катализе первоначально ставилась под сомнение, поскольку pH-зависимость катализа показывает участие непротонированной группы с рКа 4,2. Это значение рК& приписывалось карбоксильной группе остатка аспарагиновой кислоты. Однако кристаллографические данные показали, что ближайшая к Cys25 карбоксильная группа
О
(Asp15b) находится от SH-группы на расстоянии <*7,5 А. По-видимому, низкое значение рК гистидина обусловлено взаимодействием с тиолат-ионом Cys25.
Хотя существует формальная аналогия между системой Asn182-Hls159-Cys25 и системой переноса заряда в химотрипсине (Asp102-Hls57-Ser195), очевидно, что у цистеиновых протеиназ такая система отсутствует и роль связи Asn182-Hls159 заключается в фиксации положения имидазольного кольца гистидина.
В активном центре цистеиновых протеиназ расположена также боковая цепь остатка Gln19. Ее 0е1-атом образует водородную связь с От-атомом остатка Seri 83.
Рис.25. Область активного центра папаина [1262]
Пунктиром показаны водородные связи. М - метанол (кристаллизационный), 42 - молекула воды, 7 -углерод, 2 - азот, з - кислород
Окружающие активный центр боковые цепи неполярных аминокислот образуют связывающий субстратный участок. Довольно глубокий "карман", удаленный от каталитически активных групп настолько, что он, по-видимому, связывает второй (Р2) от расщепляемой группы остаток субстрата (в сторону N-конца), образован бокоЁыми цепями Тугб7, Рго68 и Val133 и Val157 второго лпмена.
Глубина щели активного центра по оценкам, сделанным с помощью спин-ме-
