Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Другой каталитически важной группой является имидазольная группа остатка Hls57 (в последовательности а-химотрипсина). Указания на важность этой группы были получены при исследовании pH-зависимости катализа сериновыми протеазами: была обнаружена группа с рКа«7, функционирующая в непротониро-ванном состоянии. В дальнейшем удалось найти специфические соединения, реагирующие с остатком His57. Ими оказались галоидкетоны, производные ациламинокислот и пептидов [1323]:
Н”! 2 Ь=\
N^JSTH+ C1CH2C0CHR -> №^NCH2COCHR2-
NHCOR4 NHCOR1
Эти соединения полностью инактивировали сериновые протеазы. Последовательность аминокислот вблизи остатка Hls57 также оказалась весьма консервативной для большого числа ферментов этой группы.
Значение остатка Hls57 было выявлено также при метилировании Иег-атома имидазольной группы этого остатка метиловым эфиром .я-нитробензолсульфокис-лоты [1324]. Оказалось [1325,1326], что N-метилхимотрипсин практически лишен каталитической активности, но сохраняет способность связывать субстраты. Таким образом, модификация затрагивает каталитический, но не связывающий участок активного центра.
Дальнейшие успехи в установлении строения активных центров сериновых протеаз обусловлены главным образом результатами рентгеноструктурного анализа. Было установлено, что гидроксильная группа Ser195 и имидазольное кольцо Н1з57 расположены в а-химотрипсине вблизи поверхности молекулы в области низкой электронной плотности. Эта область в молекулах ацилированных по Ser195 производных (или тозилированном производном) занята боковой цепью (обычно ароматической группой) ацильного остатка и носит название "тозиль-ная яма". Ne2-Atom остатка Hls57 расположен довольно близко к От-атому остатка Ser195.
В ходе кристаллографических исследований было установлено, что Nc1-3tom
His57 взаимодействует с карбоксильной группой остатка Asp102 (ранее считавшейся остатком аспарагина). Близкое расположение трех функциональных груш Asp102, His57 и Ser195 позволило сформулировать гшотезу активации гидроксильной группы Ser195 путем переноса протона на Asp102 по так называемой цепи переноса заряда [13273:
His57 Hls57
Asp102-C'
,0
Asp102
II-LOJI о
Sn f
NH...0
er195
4O“...Mn^N...H-0 ' n0-H...NvNH.
В дальнейшем концепция цепи переноса заряда в нативном ферменте подвергалась критике и в настоящее время ставится под сомнение многими исследователями (подробнее см гл.7.).
Исследование кристаллов стабильных О-ацилпроизводных а-химотрипсина позволило обнаружить взаимодействие карбонильного кислорода ацильной группы с КН-группами остатков Ser195 и Gly193 в осногной цепи фермента. Эти группы образуют так называемую оксианионную полость [1328]. Наконец, исследование модифицированных по Hls57 пептидными хлорметилкетонами кристаллов 7-химо-трипсина дало возможность идентифицировать [1329,1330] группы фермента, входящие в субстратсвязывающий участок. Это *полипептидная цопь остатков 214-216, с которыми пептидный субстрат образует, по-видимому, антипарал-лельную р-структуру.
На рис.24 представлена модель расположения атомов в активном центре
Рис.24. Область активного центра протеазы А из Streptomусее grleeus [1254] Пунктиром показаны водородные связи; Q - молекула воды; 1- углерод,
2- азот, 3- кислород
близкого аналога а-химотрипсина - протеазы А из Streptamyces grlseus, для которой рентгеноструктурные данные были получены с высоким разрешением
О
(1,5 А). Эта модель практически не отличается от модели для а-химотрипсина,
о
полученной с разрешением 1,68 А.
"Тозильная яма" - участок связывания боковой цепи субстратной аминокислоты, образующей своей карбоксильной группой расщепляемую связь - представ-
о
ляет собой довольно узкую щель, размеры которой таковы (12x6,5x4 А), что в ней может разместиться ароматический остаток фснилалан-ша, тирозина или триптофана. Этот участок активного центра образован преимущественно боковыми цепями неполярных аминокислот и пептидными связями основной цепи (190-191, 191-192 и 215-216). В глубине "ямы” расположены важные остатки, определяющие специфичность фермента. Это остаток Ser189 в а-химотрипсине и остаток Asp189 в трипсине. Остатки Gly216 и Gly226 в химотрипсине и трипсине индифферентны в отношении связывания субстрата, но у эластазы, специфичной к неполярным аминокислотным остаткам с короткой боковой цепью, в этих положениях имеются остатки Val216 и Т1.Г226, препятствующие вхождению в полость объемистых боковых цепей субстрата. "Тозильная ямаг в а-химотрипсине и родственных ферментах экранирована от окружающей среды боковой цепью остатка Metl92.
