Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
Флуорохромирование проводят либо прижизненное, либо на фиксированных препаратах. Прижизненное флуорохромирование в свою очередь может быть осуществлено или на целом животном или растительном организме (путем инъекции или введения с пищей), или на отдельных тканях и клетках. Прижизненное флуорохромирование особенно полезно при исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей и клеток.
Для изучения экскреторной функции органов наиболее употребительны натриевая соль флуоресцеина (уранин), трипафлавин и тиофлавин. Для исследования состояния клеток, ядерных и цитоплазматических нуклеопротеидов применяют акридиновый оранжевый и аурофосфин. Прижизненное выявление липоидов и жиров производят при помощи фос-фина, нейтрального красного, нильского голубого или насыщенного раствора бензпирена (в водном растворе кофеина).
Фиксацию объектов для последующего флуорохромирования производят в 96%-ном спирте или в смеси Карнуа (спирт, хлороформ и уксусная кислота в соотношении 6:3:1). Можно фиксировать и в формалине; следует, однако, помнить, что этот фиксатор вызывает частичную деполимеризацию дезоксирибонуклеиновой кислоты. Флуорохромирование осуществляют водными или спиртовыми растворами флуорохромов (1:1 - 2 тысячи) в течение 10-30 секунд или, если концентрация раствора флуо-рохрома еще меньше, несколько дольше. В ряде случаев водные растворы флуорохромов целесообразно готовить на буферных растворах. Это особенно существенно для флуорохромов, обладающих так называемой люминесцентной метахромазией, т. е. флуорохромов, цвет свечения которых зависит от физико-химических свойств субстрата, с которым они связываются. Так, например, для отчетливого различения в клетках дезоксирибонуклепротеидов и рибонуклепротеидов применяют акридиновый оранжевый; pH его растворов должно иметь значение от 3,5 до 5,5 [6].
Живые и переживающие ткани и клетки, а также одноклеточные организмы, прижизненно флуорохромируются непосредственно на предметном стекле, накрываются покровным стеклом и исследуются с помощью люминесцентного микроскопа. Чтобы препараты не подсыхали - покровное стекло прикрепляют к предметному парафиновой рамкой.
Для приготовления постоянных препаратов флуорохромированные срезы или фиксированные мазки на предметных стеклах быстро промывают в дистиллированной воде или буфере, проводят через 96°-ный спирт, карбол-ксилол и заключают в акриловый клей, полистирол или винилин. Акриловый клей представляет собой раствор метакриловой смолы, поли-меризованной в ксилоле. Он быстро высыхает и вполне прозрачен для видимого и ультрафиолетового света до 300 ммк. Его применение для люминесцентной микроскопии было предложено Бухман с сотрудниками [7]. Шалумович рекомендует заключать в сахарный сироп [22, доп. сп. ].
Если полное обезвоживание объекта нежелательно, то в качестве заключающей среды может.быть использован винилин [8].
314 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ [ГЛ. XVIIJ
Срезы и мазки хорошо сохраняются в полистироле [9], если они хорошо обезвожены в 96%-ном алкоголе и проведены через карбол-ксилол. Гуткиной, Арутюновым и Мамулем был недавно рекомендован [10] быстрый и вместе с тем не портящий флуорохромы метод обезвоживания препаратов при помощи спирта или лиофильной сушки.
Если флуорохромированные препараты не подлежат длительному хранению, то исследовать их можно в воде или в глицерине.
Фотографирование люминесцентных препаратов лучше всего производить йа цветную негативную пленку, отличающуюся высокой чувствительностью (JIH-3); можно также непосредственно получать диапозитив, используя для этого цветную обратимую пленку, чувствительную для дневного света. При фотографировании выгодно пользоваться окуляром с наименьшим увеличением. Продолжительность экспозиций - от нескольких секунд до нескольких минут. Бируковым разработаны специальные методы люминесцентной микрокиносъемки [11].
4. Люминесцентная микроскопия в цитологии и гистологии.
Прижизненное флуорохромирование
Люминесцентная микроскопия принадлежит к наиболее тонким методам исследования структуры, биохимического, физико-химического и функционального состояния клеток.
Флуорохромы связываются с компонентами микроскопических препаратов по-разному: электростатически - связями типа солеобразных и более слабо - силами типа ван-дер-ваальсовых. Этим объясняется то, что, в зависимости от особенностей физико-химической природы, отдельные структуры и компоненты на срезах из тканей могут люминесцировать по-разному, хотя соответствующие препараты изготовлены с использованием одного и того же флуорохрома.
Нередко контрастность свечения увеличивается за счет собственной люминесценции отдельных структур, кроме того, в ряде случаев флуорохромы растворяются только в некоторых из компонентов препарата (например, в жирах и липоидах). -
Хорошие результаты в отношении цветовых различий и контрастов дает иногда применение смеси флуорохромов (или последовательная обработка одного и того же препарата различными флуорохромами). Флуорохромы подбираются при этом так, чтобы каждый из них контрастировал определенную деталь в препарате. Не меньшее значение имеет прием, позволяющий более или менее избирательно тушить или изменять цвет или интенсивность люминесценции отдельных компонентов объекта; благодаря этому остальные компоненты, продолжающие ярко люминесцировать, могут быть выявлены особенно четко. Для такого тушения или легкого изменения характера люминесценции применяются красители слабо люминесцирующие (фуксин, магдаловый красный) или совсем не люмине-сцирующие (конго красный) или, наконец, известные тушители люминесценции (например, марганцевокислый калий).
