Справочник по производству спирте. Сырье, технология и технохимконтроль - Яровенко В.Л.
Скачать (прямая ссылка):
Проведение испытания. 5 мл испытуемого раствора ферментного препарата, нагретого до 30° С, приливают к 10 мл 1%-ного раствора крахмала, нагретого до этой же температуры, и выдерживают 10 мин в ультратермостате при 30° С. Точно через 10 мни отбирают 1 мл гидрслизата, переносят его в маленькую пробирку, помещенную в кипящую водяную баню, инактивируют фермент в течение 2 мин и затем охлаждают холодной водой.
Для определения содержания глюкозы в каждую пробирку с охлажденным гидролизатом вносят по 3 мл рабочего раствора C1 перемешивают и оставляют иа 45 мин при комнатной температуре.
Одновременно с исследуемой пробой готовят контрольную. Для
этого 5 мл раствора ферментного препарата кипятят на водяной бане в течение IO мин (для инактивации фермента), после охлаждения добавляют 10 мл 1%-ного раствора крахмала. Все последующие операции с контрольными пробами такие же, как и с опытными.
Кроме указанной контрольной пробы иа инактивированный фермент ставят контрольную пробу на рабочий раствор С. Для этого к 3 мл рабочего раствора приливают 1 мл дистиллированной воды.
Интенсивность окраски полученных растворов определяют на фотоэлектроколориметрах ФЭК-56 с длиной волны А,=440 ни и ФЭК-60 с длинами волн 390 и 418 им, пользуясь кюветами толщиной 1 см.
Для построения градуировочиой кривой исследуют стандартные растворы глюкозы, к 1 мл которых добавляют 3 мл рабочего раствора С. Окраска развивается в течение 45 мин, после чего измеряют их оптическую плотность на фотоэлектроколориметре. По полученным значениям строят градуировочиую кривую (по оси абсцисс откладывают количество глюкозы, по оси ординат - соответствующую оптическую плотность). Рабочая зона градуировочиой кривой лежит в области 10-150 мкг глюкозы.
Если контрольные пробы на инактивированный фермент имеют заметную окраску, в качестве раствора сравнения при колоримет-рировании берется рабочий раствор. Величина оптической плотности должна лежать в рабочей зоне градуировочиой кривой, т. е. в пределах оптической плотности, соответствующей количеству глю-"озы от 10 до 150 мкг.
Если при измерении интенсивности окраски исследуемой пробы полученные значения не укладываются в градуировочиую кривую, опыт повторяют с меньшим количеством исследуемого ферментного препарата.
По полученным значениям экстинкций исследуемой пробы находят количество глюкозы, образовавшейся в результате действия фермента. Глюкоамилазную активность ГлА (в ед./г или ед./мл) определяют по формуле ГлА=а/(6-180-10), где а - количество глюкозы, образовавшейся в гидролизате за счет действия фермента, мкг/мл; b - количество фермента в 1 мл гидролизата, г или мл; 180 - молекулярная масса глюкозы; 10 - время гидролиза, мин.
Пример. 100 мг препарата растворяют в колбе вместимостью 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 15 мл приготовленного раствора вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем до метки дистиллированной водой и определяют количество фермента в гидролизате В (в г): S=O1IX Х15-5,1/(100-100-15) =0,00005.
В результате колориметрироваиия этого раствора получена величина D = 0,173. По градуировочиой кривой этой величине D соответствуют 87 мкг глюкозы. Подставляя эту величину в формулу, определяют значение глюкоамнлазной активности (в ед./г): ГлА= - 87/(0,00005-180-10) = 967.
Определение осахаривающей активности (ОС). Осахаривающая активность определяется йодометрическим методом в соответствии с ГОСТ 20264.4-74. Метод основан на гидролизе растворимого крахмала (глюкозндных связей) исследуемым ферментом с последующим йодометрическим определением количества образовавшихся Сахаров.
19-702
289
Осахаривающая активность характеризует способность амнло-литических ферментов катализировать осахаривание крахмала до восстанавливающих Сахаров - мальтозы или мальтозы в смеси с глюкозой.
За единицу осахаривающей активности принято такое количество фермента, которое в строго определенных условиях за 1 мин при 30° С катализирует расщепление до восстанавливающих Сахаров 1 микроэквивалента глнкозидных связей.
Приготовление 1%-ного раствора крахмала (субстрат) и ацетатного буферного раствора с рН4,7-как и при определении АС.
Приготовление 0,1 н. раствора йода. 15 г йоднда калия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в минимальном количестве дистиллированной воды и туда же вносят 12,7 г йода. После полного растворения йода объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой. Концентрация раствора не должна быть ниже 0,95-1,05 н. Титр проверяют по раствору тиосульфата.
Приготовление 0,1 н. раствора тиосульфата (N2S2O3). 25 г тиосульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в дистиллированной воде, не содержащей диоксида углерода. Приготовленный раствор хранят в склянке из темного стекла с сифоном и бюреткой с хлоркальциевой трубкой, заполненной натронной известью. Титр раствора устанавливают обычным методом по дихромату калия после выдержки раствора тиосульфата в течение 15 сут.
