Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Максимальная активность пепсина по отношению к большинству синтетических субстратов наблюдается при рН4. В случае белковых субстратов и синтетических субстратов с последовательно расположенными ароматическими аминокислотными остатками, например ацетилфенилаланилфенил-аланина, максимальная активность пепсина проявляется при pH 2. Однако при такой высокой кислотности среды пепсин вследствие аутолиза неустойчив. Пепсин максимально устойчив при рН5—5,5 и быстро денатурируется при рН6.
208
Селективное расщепление белков
Действие пепсина на цепи А [267] и Б [272] окисленного инсулина (рис. 1 и 2), на кортикотропин [23] (рис. 6) и окисленную рибонуклеазу [17] (рис. 4) изучено довольно подробно.
Действие пепсина на различные белки
Таблица 3
Расщепляемые связи
Устойчивые связи, в образовании которых участвует аминогруппа тирозина или фенилаланииа
Окисленный инсулин цепь А
цепь Б
Кортикотропин
Окисленная рибонуклеаза
Глу. Глу (NH2)
4 5
Лей. Тир
13 14
Тир. Глу (NH2)
14 15
Н. Фе. 1
Вал
2
TAy(NH2). Гис
4 5
Лей. Вал П 12
Глу. Ала
13 14
Ала. Лей
14 15
Глу.
Гис б
Глу. Асп
28 29
Асп. Глу (NH2)
29 30
Глу (NH2). Лей зо зі
Ала.Ала
5 б
Фе. Глу
8 9
Тре. Фе
45 46
Фе. Асп
120 121
Глу (NH2). Лей
15 16
Лей. Глу
16 17
Глу. Асп (NH2)
17 18
Лей. Тир
15 16
Тир. Лей
16 17
Гли. Фе '
23 24
Фе. Фе
24 25
Фе. Тир
25 26
Глу. Ала
33 34
Фе. Про
35 36
Глу. Фе. ОН
38 39
Фе. ?
Связи 51—52,
55—56,
108—109
ACn(NH2). Тир
18 19
Н. Сер. Тир
1 2
Гис. Фе
6 7
Вал. Тир
22 23
Лиз. Фе
Ци SO3H. Тир
72 73
Сер. Тир
75 76
Лиз. Тир
91 92
Ци SO3H-THp
96 97
Ала. Тир
114 116
?. Фе
119 120
В табл. 3 показаны связи, разрываемые пепсином, а также те связи, на которые пепсин должен был бы действовать, судя по его специфичности, установленной на синтетических суб-
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 209
стратах. Попытка четко разграничить легко гидролизующиеся и частично гидролизующиеся связи оказалась безуспешной; поскольку во многих случаях разрыв некоторых связей влияет на гидролиз соседних связей, которые обычно легко разрываются. Кроме того, следует отметить, что данные по расщеплению рибонуклеазы неполны, так как до сих пор точный порядок расположения некоторых аминокислотных остатков не известен.
Однако, как показывает табл. 3, многие связи, в которых не участвуют остатки ароматических аминокислот, гидролизуются, в то время как многие связи, которые должны были бы разрываться в данных условиях, оказались устойчивыми. По-видимому, это можно объяснить тем, что субстрат фактически подвергается действию нескольких ферментов, или тем, что до настоящего времени недостаточно выяснены особенности структуры, необходимой для осуществления атаки со стороны пепсина.
Принятый метод обозначения мест атаки фермента на субстрат порядковыми номерами остатков не может передать всю сложность состава гидролизатов. Например, в случае цепи А окисленного инсулина инкубирование с пепсином приводит к образованию семи пептидов за счет разрыва четырех связей, указанных ниже:
—Тир. Глу (NH2). Лей. Глу. Асп (NH2). Тир. UhSO3H. Асп (NH2). ОН
14 15 16 17 18 19 20 21
j t J j
Н. Тир. Глу (NH2). ОН
Н. Тир. Глу (NH,). Лей. ОН
Н. Тир. Глу (NH2). Лей. Глу. ОН
Н. Лей. Глу. Асп (NH2). Тир. UhSO3H. Асп (NH2). ОН Н. Глу. Асп (NH2). Тир. UhSO3H. Асп (NH2). ОН Н. Асп (NH2). Тир. UhSO3H. Асп (NH2). ОН Н. Лей. Глу. ОН
Сложность состава этого- гидролизата до некоторой степени можно объяснить ингибированием пепсина соседними с гид-ролизуемой связью аминогруппами. Так, молекула, разрывающаяся сначала по связи в положении 16—17, с трудом будет гидролизов аться по связи 17—18 и т. д.
Несмотря на низкую специфичность пепсина, из гидролизата цепи А инсулина был выделен большой N-концевой пептид, состоящий из тринадцати аминокислотных остатков, что в сочетании с данными по составу пептидов, образующихся в результате частичного кислотного гидролиза, позволило установить последовательность аминокислот в цепи А инсулина [267].
14 Зак. 1416
210
Селективное расщепление белков
Кортикотропин свиньи расщепляется под действием пепсина аналогичным образом, давая три крупных активных обломка [23], состоящих из остатков 1—28, 1—30 и 1—31. Большое количество мелких пептидов получено из хвостового участка цепи кортикотропина, легко подвергающегося гидролизу [23, 196].
В противоположность далеко идущему гидролизу окисленной рибонуклеазы при действии пепсина в определенных условиях на нативный белок гидролизуется только одна пептидная связь с отщеплением от С-концевого участка тетрапеп-тида и образованием вещества, лишенного ферментной активности [8]. -
Папаин. Этот внутриклеточный фермент в настоящее время получают в исключительно чистом кристаллическом виде из экстрактов продажного сухого латекса дынного дерева (Carica papaya) [178]. Активность фермента зависит от наличия одной сульфгидрильной группы [296]. В присутствии восстановителя (например, цистеина или цианида) икомплек-еообразующёго реагента (например, этилендиаминтетрааце-тата) получаются воспроизводимые активности ферментного препарата.
