Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Ферментативный гидролиз нативных белков, как правило, протекает менее полно, чем гидролиз денатурированных белков и белков с разделенными цепями в аналогичных условиях [128]. Во многих случаях в результате такого более специфического расщепления получаются более крупные обломки исходной молекулы. Ранее отмечалось, что после окисления рибонуклеаза в большей степени подвержена ферментативному гидролизу.
Ферменты устойчивы при низких температурах, и ферментативный гидролиз часто проводят при 25°. Однако, как ив случае большинства химических реакций, при повышении
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 179
температуры резко возрастает скорость реакции. Поэтому -для ускорения гидролиза связей,. медленно расщепляемых ферментом, температуру инкубирования часто повышают до 37—40°. Другим способом увеличения скорости протеолиза является повышение отношения фермент/субстрат.
В данном разделе специфичность протеолитических ферментов рассматривается применительно к селективному расщеплению полипептидов и белков с известным порядком расположения аминокислот. Следует, однако, иметь в виду, что порядок расположения аминокислотных остатков в цепи не определяет полностью пространственные взаимодействия. При свертывании цепи и появлении, например, структуры о-спи-рали боковые цепи последовательно расположенных аминокислотных остатков выступают из спирали через определенные промежутки и повернуты друг к другу на угол, равный примерно 100° по отношению к оси спирали. Свобода вращения боковых цепей обусловливает значительное разнообразие занимаемых ими положений: они могут быть удалены от другой боковой цепи или пептидной связи, расположенных на расстоянии нескольких аминокислотных остатков в главной цепи, на такое же расстояние, как и от своего аминокис лотного остатка или пептидной связи. Кроме того, возможно взаимодействие между боковыми цепями и пептидными связями, расположенными рядом геометрически, но принадлежащими к значительно удаленным друг от друга в цепи аминокислотным остаткам или даже к другой поли пептидной цепи молекул. Таким образом, знание пространственной конфигурации может оказаться столь же важным при решении рассматриваемого вопроса, как и знание последовательности расположения аминокислот.
Важно также знать, что-1 исследуемое вещество содержит остатки аспарагиновой или глутаминовой кислоты, а не аспа-рагина или глутамина.
'Трипсин
Свойства трипсина подробно рассмотрены в ряде работ [128, 228, 294], что позволяет ограничиться кратким изложением основных данных.
Активный фермент (мол. вес 23000—24 000) [128] образуется из неактивного трипсиногена при действии на него Трипсина [228] или энтерокиназы [346], приводящих к разрыву связи — Лиз . Илей — и of щепленню .пептида состава Н.Вал. (АспЬ.Лиз.ОН [69, 76] от N -концевого участка полипептидной цепи. Таким образом, N-концевыми группами трипсиногена и трипсина являются соответственно валин и изолейцин
12*
180
Селективное расщепление белков
[75]. С-Концевой остаток как трипсиногена, так и трипсина, по-видимому, представляет собой лизин ([104, 226]; см. также^]).
Активность трипсина проявляется при pH 7—9; по отношению к некоторым синтетическим субстратам оптимальная активность трипсина наблюдается при pH 7,8 [128]. В этих пределах значений pH фермент легко претерпевает аутолиз; максимальная стабильность фермента наблюдается при pH 2,3 н 30° [228]. Трипсин более устойчив в присутствии субстрата. Найдено, что раствор трипсина при pH 7,9 и 26° теряет 50% активности за 30 мин в отсутствие Ca2+ и полностью инактивируется за 6 час [125]. Инактивирование фермента в значительной степени замедляется в присутствии Ca2+ [31, 77, 125]. Так, в указанных выше условиях, но в присутствии 0,01 моля Ca2+ потери активности составляет всего 5% за 8 час.
Трипсин стабилизируется также ацнлированием [246]. Поскольку молекула трипсина содержит 13 лизиновых остатков и только 2 аргининовых остатка [128], которые образуют потенциально способные гидролизоваться при аутолизе связи, при ацилировании є-аминогрупп лизиновых остатков связи, в которых участвуют эти остатки, становятся устойчивыми к гидролизу. Таким образом, ацилирование уменьшает количество чувствительных к гидролизу связей и тем самым повышает гидролитическую устойчивость фермента.
Результаты опытов с синтетическими субстратами показывают [27], что трипсин атакует пептидную ^вязь, в которой участвует карбоксильная группа /-аргинина (VIII) или /-лизина (IX). Типичными синтетическими субстратами являются бензоиллизиламид и бензоиларгиниламид. При защите є-ами-ногруппы лизинового остатка каким-либо заместителем чувствительность субстрата к действию трипсина исчезает.
NH \
CH-Ch2-CH2-CH2-NH-C-NH2
со
NH
VIII
nh
CH-CH2-CH2-Ch2-CH2-NH:
:2
со
IX
Реагенты, рас/цепляющие связи в полипептидной цепи 181
В последнее время показано, что перевод е-аминогруппы лизина а-лактоальбумина в гуанидильную группу, т. е. получение остатков гомоаргинина (X), также обусловливает полную стабильность ранее легко расщеплявшихся трипсином пептидных связей [336]. С другой стороны, перевод цистино-вых остатков в S-(р-аминоэтил)цистеиновые остатки (XI) восстановлением тиогликолятом с последующим взаимодействием с 2-бромэтиламином дает боковую цепь, весьма напоминающую боковую цепь лизина. Поли-S-({З-аминоэтил) цистеин является субстратом для трипсина [204] так же, как и полилизин. Введение этих остатков в полипептидные цепи вместо полуцистиновых остатков должно повысить гидролизуемость полипептида трипсином. Этот тип превращения может оказаться полезным для определения последовательности аминокислот в белках [204, 321]. Гистидин и орнитин не могут заменить остатки аргинина, лизина или 5-(Э-аминоэтил)цистеина.
