Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
В аффинной хроматографии клеток обычно возникают проблемы двух основных топов:
1) неспецифическое взаимодействие между клетками и аффинными носителями;
2) Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем: хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем: каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело; это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией.
248
Глава 8
В некоторых случаях оказалось возможным возвратить клетки, первоначально связанные с иммобилизованными лигандами, с использованием избытка лиганда или конкурентного лиганда [16—18, 24], но эта идеальная ситуация редко реально осуществима. В большинстве случаев должны быть найдены другие возможности [1—4]: плавление носителя [25, 26], ферментативная деградация носителя [27], механическое отделение. Все эти методы могут повредить клетки. Даже пипетирование создает возможность потери рецепторов с клеточной поверхности. Якобович и др. [28] недавно использовали преимущество этого необратимого связывания клеток с аффинными матрицами для отделения лектиновых рецепторов эритроцитов механическим разрывом иммобилизованных комплексов лектинов и связавшихся клеток.
Интересным путем преодоления необратимости связывания клеток с аффинными матрицами является использование эритроцитов быка в качестве носителя (табл. 1), так как клетки могут быть выделены из розетки селективным лизисом эритроцитов.
Другая попытка была предпринята Кифером [29] и Кембье-ром и Нилом [30], которые выделили антигенспецифичные лимфоциты включением расщепляемого дисульфидного мостика между твердым носителем и связанными гаптенами или антигенами. Однако расщепление этих S—S-связей путем обработки тиолом иногда протекает с трудом, что вызывает необходимость дополнительной механической обработки [30].
Очевидно, что в настоящее время нет единого универсально- ч го метода для выделения клеток аффинной хроматографией, главным образом из-за того, что элюирование интактцых функциональных клеток с аффинных матриц остается трудной задачей.
3. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ КЛЕТОК С ЛИГАНДАМИ, ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ЧЕРЕЗ РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ СВЯЗИ РТУТЬ —СЕРА
С целью преодоления некоторых недостатков описанных выше методов была осуществлена иммобилизация лигандов через вставки, содержащие Hg—S-связи, расщепляемые при обработке тиолом легче, чем дисульфидные связи. Ртутьоргани-ческое соединение мерсалил {натриевая соль о-[3-(гидроксимер-кури) -2-метоксипропилкарбамоил] -феноксиуксусной кислоты} ковалентно связывали с активированными шариками трисакрила и полученное иммобилизованное ртутьсодержащее соединение обрабатывали лигандами с тиольными группами: образующиеся Hg—S-связи легко расщепляются под действием дитио-треитола [31].
Разделение клеток
249
3.1. Описание метода
3.1.1. Носитель. Носитель представляет собой трисакриловые шарики (Trisacryl GF05, Reactifs IBF, Франция). Основная особенность этого носителя — наличие трех гидроксиметильных групп и одной алкиламидной группы на каждое основное повторяющееся звено. Благодаря этим химическим группам полимер очень гидрофилен и удобен для разделения биологических макромолекул, особенно белков, и клеток. Эта матрица имеет очевидное преимущество над носителями на основе полиакрилами-да или гидроксиметилметакрилата, которые обладают ярко выраженным гидрофобным характером. Кроме того, трисакриловые шарики не проявляют неспецифических взаимодействий с клетками, главным образом потому, что в отличие от классических хроматографических матриц они не содержат углеводных компонентов.
3.1.2. Активация трисакрила. Введение первичных аминогрупп в трисакриловые шарики проводят в соответствии со схемой, представленной на рис. 1, реакцией с эпихлорогидрином в присутствии тетрафторобората цинка [32] с последующей обработкой аммиаком.
Концентрация NH2-rpynn, определенная фронтальным анализом, составляет —50 мкмоль/мл геля.
3.1.3. Присоединение мерсалила' к трисакрилу-ЫН2. Амидная связь между карбоксильной группой мерсалила и аминогруппой
CH2OH матрица-С0-МН-С-СН20Н трисакрил ^h2Q4
CH2-CH-CH2CI
Zn(BFJ2
CH2OH он MaTpMUa-CO-NH-C-CH2-O-CH2-CH-CH2Cl CH2OH
NH4OH
Рис. 1. Введение первичных аминогрупп в трисакриловые шарики.
17—139
250
Глава 8
матрицы образуется при действии конденсирующего агента Ы-этоксикарбонил-2-этокси- 1,2-дигидрохинолина (ЭЭДХ) [33, 34J (рис. 2). Реакция конденсации осуществляется в смеси этанол— вода (1:1); растворимость мерсалила удовлетворительна для протекания этой реакции в отличие от других классических ртутьорганических соединений (таких, как л-хлоромеркурибен-зойная кислота).
